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REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - FÉVRIER 2013 - N°449 // 47 article reçu le

REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - FÉVRIER 2013 - N°449 // 47 article reçu le 6 juin, accepté le 6 juillet 2012. © 2013 – Elsevier Masson SAS – Tous droits réservés. SUMMARY Integration of Capillarys 2 Flex Piercing (Sebia) in the daily practice of a specialized pathology laboratory The applications of capillary electrophoresis in medical diagnostics have expanded considerably since the early 2000s. The goal of this study was to evaluate the integration of the new generation of automated capillary electrophoresis instrument, the Capilla- rys 2 Flex Piercing (Sebia), in the daily practice of a specialized pathology laboratory. In this study, we demonstrated a very good correlation between the results obtained with the Capillarys 2 Flex Piercing and the previous generations of Capillarys for the quantification of Carbohydrate Deficient Transferrin (CDT), and the quantification of the different serum proteins fractions. Similarly, the detection and the quantification of hemoglobin fractions (variants and HbA1c) were compared between Capillarys 2 Flex Piercing and high performance liquid chromatography (HPLC). We tested the performances of the Capillarys 2 Flex Piercing in daily routine conditions, showing the reliability, robustness and usability of this polyvalent new instrument for electrophoresis. Capillary electrophoresis – protein electrophoresis – hemoglobinopathies – HbA1c – carbohydrate-deﬁcient transferring. RÉSUMÉ Les applications de l’électrophorèse capillaire dans le domaine de la biologie médicale se sont considérablement étendues depuis le début des années 2000. Notre étude a pour but d’évaluer l’intégration en rou- tine d’un automate d’électrophorèse capillaire de nouvelle génération, le Capillarys 2 Flex Piercing (Sebia), au sein d’un laboratoire spécialisé. Au cours de cette étude, nous avons montré la très bonne corrélation entre le Capillarys 2 Flex Piercing et le Capillarys 2 « ancienne génération » pour la quantification de la transferrine désialylée (CDT) et des différentes frac- tions des protéines sériques, mais également par rapport aux techniques de chromatographie liquide haute performance (HPLC) pour la recherche et la quantification des fractions de l’hémoglobine (variants et HbA1c). Nous avons également éprouvé les performances du Capillarys 2 Flex Piercing dans les conditions réelles d’utilisation, en montrant la fiabilité, la robustesse et l’ergonomie de ce nouvel automate d’électrophorèse polyvalent. Electrophorèse capillaire – électrophorèse des protéines – hémoglobinopathies – HbA1c – transferrine désialylée. Laurence Guisa,*, Anelise Chaumiera, Virginie Le Galla, Sabine Havreza Intégration du Capillarys 2 Flex Piercing (Sebia) dans un laboratoire de biologie médicale spécialisée a Service de biochimie Laboratoire Biomnis 78, av. de Verdun 94200 Ivry-sur-Seine * Correspondance laurence.guis@biomnis.com La technique d’immunotypage ou immunosoustraction par électrophorèse capillaire est une technologie qui s’est for- tement développée comme le montre la forte augmentation du nombre d’utilisateurs de cette technique au cours des évaluations externes de la qualité. La mise en évidence d’une dysglobulinémie est faite par immunosoustraction : l’électrophorèse est réalisée avant (tracé de référence) et après incubation du sérum avec les 5 antisérums stan- dards (anti-gamma, anti-mu, anti-alpha, anti-lambda et anti-kappa). La disparition et/ou la diminution du pic mis en évidence sur le tracé de référence permet ainsi la carac- térisation de l’immunoglobuline monoclonale. Cette technologie n’est pas utilisée en routine au sein de notre laboratoire pour des raisons de volumes (cadence de 10 échantillons par heure) et de recrutement, notre laboratoire pouvant être sollicité pour contrôler en gel d’agarose (immunofixation) des profils d’immunotypage délicats d’interprétation. Nous avons ainsi jugé que le peu 1. Introduction L’électrophorèse capillaire est une technologie qui a long- temps été utilisée en recherche mais qui, depuis la fin des années 90, a considérablement évolué afin de devenir accessible en routine aux laboratoires de biologie médi- cale. Elle se définit comme une technique de séparation électrocinétique effectuée dans un tube de diamètre interne inférieur à 100 μm rempli d’une solution d’électrolytes. Le système Capillarys (Sebia) était initialement conçu pour l’électrophorèse capillaire des protéines sériques [1] mais les applications de l’automate se sont étendues depuis 2005 à l’immunotypage (identification immunologique des immunoglobulines monoclonales) [2, 3], à la quantification de la transferrine désialylée (CDT) pour le dépistage d’une consommation excessive d’alcool [4], à la recherche d’une anomalie génétique de l’hémoglobine [5, 6] et récemment à la mesure de l’hémoglobine glyquée (HbA1c). 48 // REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - FÉVRIER 2013 - N°449 d’expérience dans l’interprétation de cette analyse ne nous permettait pas d’évaluer les performances analytiques de ce test sur Capillarys 2 Flex Piercing. Au sein du laboratoire Biomnis, nous utilisons en routine le système Capillarys pour la réalisation des électropho- rèses de protéines sériques, la quantification des CDT et la caractérisation des anomalies de l’hémoglobine en seconde intention. Le facteur limitant pour l’utilisation en première intention du Capillarys dans la recherche d’une hémoglobinopathie tient dans la nécessité de travailler sur culot globulaire, ce qui implique la centrifugation des tubes afin de séparer le plasma des globules rouges. De ce fait, cette technique est peu adaptée aux grandes séries (environ 150 dépistages par jour dans notre laboratoire). Depuis, Sebia a mis au point une nouvelle génération d’automates d’électrophorèse, le Capillarys 2 Flex Pier- cing, qui présente l’avantage de pouvoir travailler direc- tement sur sang total prélevé sur EDTA sans préparation pré-analytique des échantillons. Grâce au système « cap piercing », le prélèvement s’effectue directement sur tubes primaires bouchés. Le but de cette évaluation était d’éprouver les perfor- mances du Capillarys 2 Flex Piercing dans les conditions réelles d’utilisation d’un laboratoire spécialisé pour les différentes techniques citées ci dessus. Les résultats des électrophorèses des protéines sériques et des CDT ont été comparés à ceux des Capillarys « ancienne généra- tion » présents au laboratoire. La détection des variants de l’hémoglobine, la quantification des fractions de l’hé- moglobine (HbA, HbF et HbA2), ainsi que la mesure de l’HbA1c ont été comparées à celles obtenues sur notre système de chromatographie liquide haute performance (HPLC Variant II, Bio-Rad). Nous avons également éva- lué la fiabilité, la robustesse et l’ergonomie de ce nouvel automate d’électrophorèse capillaire. 2. Matériel et méthodes Toutes les analyses ont été réalisées sur des échantillons non sélectionnés et ont été effectuées dans les mêmes conditions de travail qu’une pratique quotidienne de routine. Selon la technique étudiée, les analyses ont été faites sur Capillarys « ancienne génération » (Sebia, Lisses, France), Capillarys 2 Flex Piercing (Sebia) ou HPLC Variant II Bio-Rad (Hercules-California, USA). Les analyses ont été effectuées avec les trousses Capillarys Protein 6 (référence 2003, Sebia), Capillarys CDT (référence 2008, Sebia), Capillarys Hemoglobin (référence 2007, Sebia) et Capillarys HbA1c (référence 2015, Sebia). En ce qui concerne le dépistage des hémoglobinopathies et le dosage de l’HbA1c par HPLC, la trousse utilisée était la V2_B-THAL_DU (Bio-Rad). Pour l’évaluation de la technique CDT, 56 sérums de routine ont été analysés en parallèle sur Capillarys 2 « ancienne génération » et sur le Capillarys 2 Flex Piercing. Pour l’évaluation de la technique d’électrophorèse des protéines sériques, 256 sérums de routine ont été analysés en parallèle sur Capillarys 1 « ancienne génération » et, le lendemain, sur Capillarys 2 Flex Piercing. Pour le dépistage des hémoglobinopathies, 624 sangs totaux prélevés sur EDTA ont été analysés en parallèle sur le système HPLC Variant II Bio-Rad Dual Program (méthode « β-Thal : V2_B-THAL_DU ») et, le lendemain, par électrophorèse capillaire sur le Capillarys 2 Flex Piercing. Pour l’évaluation de la technique « HbA1c », 150 sangs totaux prélevés sur EDTA, pour lesquels une demande de dosage d’HbA1c était enregistrée au laboratoire, ont été analysés en parallèle sur le système HPLC Variant II Bio- Rad Dual Program (méthode « HbA1c : V2_A1C_DUAL ») et, le lendemain, en électrophorèse capillaire sur le Capillarys 2 Flex Piercing. Nous avons également comparé les taux d’HbA1c obtenus par ces deux techniques chez 79 patients porteurs d’une hémoglobinopathie détectée par HPLC. 3. Résultats et discussion Le système Capillarys utilise le principe de l’électrophorèse capillaire en solution libre, qui représente la forme la plus courante d’électrophorèse capillaire. Les migrations se font simultanément dans 8 capillaires en silice de 25 μm de diamètre. La technologie permet la séparation de molécules chargées en fonction de leur mobilité électrophorétique dans un tampon de pH donné, et selon le pH de l’électrolyte. La température est contrôlée par effet Peltier à 35,5 °C, ce qui évite les problèmes de migration liés à certaines cryo- globulines qui peuvent précipiter à température ambiante. Les molécules sont détectées directement à une longueur d’onde d’absorption spécifique (200 nm pour les protéines sériques et la CDT, et 415 nm pour les hémoglobines et l’HbA1c). Cette détection directe permet une quantifica- tion précise de chaque fraction individualisée. Concernant l’électrophorèse des protéines sériques, le tampon utilisé permet la quantification de 6 fractions majeures : albumine, alpha-1 globulines, alpha-2 globulines, bêta-1 globulines, bêta-2 globulines et gammaglobulines (ﬁgure 1A). Les isoformes de la transferrine sont séparées avec le tampon de la trousse CDT, et la CDT est calculée par le rapport (2-sialo + 0-sialo)/Trf totale (ﬁgure 1B). La séparation et la quantification des principaux variants de l’hémoglobine (HbS, HbC, HbD, HbE) et la quantification des fractions d’hémoglobine d’intérêt pour le diagnostic de bêta-tha- lassémie (HbA2 et HbF) se font à l’aide du tampon de la trousse Capillarys Hb (ﬁgure 1C). Le Capillarys 2 Flex uploads/Finance/ capillary-s.pdf