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COLIMÉTRIE La colimétrie correspond aux méthodes de dénombrement des coliformes

COLIMÉTRIE La colimétrie correspond aux méthodes de dénombrement des coliformes. Les techniques de colimétrie ont pour objectif le dénombrement et, éventuellement, l’identification des coliformes totaux, des coliformes thermotolérants (ou coliformes fécaux) ou d’Escherichia coli en particulier. L’intérêt de ces manipulations est de déterminer pour le produit testé une contamination fécale et d’en apprécier l’ampleur, car les coliformes sont des bactéries vivant principalement dans les intestins. De plus, les coliformes thermotolérants et Escherichia coli survivant difficilement hors de l’intestin traduiront donc une contamination fécale récente. • Témoins de contamination fécale - Coliformes totaux Un coliforme est une entérobactérie fermentant le lactose à 30 ou 37 °C avec production de gaz. -Coliformes thermotolérants Un coliforme thermotolérant est une entérobactérie fermentant le lactose à 44 °C avec production de gaz. -Escherichia coli Escherichia coli est une entérobactérie fermentant le lactose à 44 °C avec production de gaz et produisant de l’indole à 44 °C. • Principe de base des techniques de dénombrement Tous les milieux utilisés contiennent du lactose. Les milieux liquides possèdent une cloche afin de mettre en évidence la production de gaz. Un certain nombre de milieux utilisent des agents sélectifs, inhibiteurs des bactéries Gram + : vert brillant, cristal violet, désoxycholate,… Des milieux récents chromogènes permettent le dénombrement direct d’Escherichia coli par mise en évidence de l’activité ß-glucuronidase. • Dénombrement des coliformes Le dénombrement des coliformes peut se faire, selon les produits, par des techniques en milieux liquides ou solides. La démonstration de la nature « coliforme » n’est jamais parfaite mais le principal est de suivre les normes permettant la standardisation des méthodes. • En milieu liquide -Milieu utilisé : BLBVB + cloche (Bouillon Lactosé Bilié au Vert Brillant) Ce milieu contient deux agents sélectifs : la bile (ou désoxycholate) et le vert brillant. Il contient des peptones et du lactose (caractère biochimique). Il n’y a pas d’indicateur de pH. La production de gaz se fait à partir de l’utilisation du lactose. - Ensemencement 1 ml de chaque dilution est introduit dans un tube de BLBVB + cloche. Homogénéiser l’inoculum afin qu’il se répartisse dans tout le tube, cloche comprise. -Incubation 24 heures à 30°C. -Lecture Si un tube par dilution La présence d’un trouble (culture) et la production de gaz dans la cloche (au moins 1/10 du volume de la cloche) permet de conclure à la présence d’au moins un coliforme dans le ml d’inoculum de la dilution testée. Si 2 ou 3 tubes par dilution on utilise la table de Mac Grady afin de déterminer statistiquement la quantité de coliformes présents dans un mL 1 -En milieu solide - Milieux utilisés : gélose au désoxycholate ou gélose VRBL Ces deux milieux contiennent du désoxycholate qui inhibe les bactéries Gram +, du lactose utilisé comme source de carbone et d’énergie et du rouge neutre (indicateur de pH permettant la lecture du caractère « lactose » : colonies rouges lactose +). Le milieu VRBL est plus sélectif du fait de la présence de cristal violet en plus du désoxycholate. -Ensemencement-incubation Le dénombrement est réalisé dans la masse des milieux pré cités en double couche. Incubation 24 heures à 30/44°C. -Lecture Toutes les colonies rouges (lactose +) d’un diamètre minimum de 0,5 mm en 24 heures sont considérés comme étant des coliformes. • Escherichia coli : test de Mackensie Le test de Mackensie permet un dénombrement d’Escherichia coli après avoir dénombré les coliformes totaux en milieu liquide (BLBVB à 30 ou 37°C). Il utilise la propriété d’Escherichia coli de produire de l’indole à 44°C et de fermenter le lactose à 44°C. - Milieux utilisés • Un tube de BLBVB • Un tube d’eau peptonée -Ensemencement Pour chaque tube positif où l’on soupçonne la présence de coliformes en BLVB, on prélève une anse de culture que l’on reporte dans un BLBVB et dans une eau peptonée. -Incubation 24 à 48 h à 44°C - Lecture Le résultat se rapportera au tube initial. Le tube BLBVB est positif s’il présente un trouble et que la cloche présente du gaz (au moins un 1/10 du volume de la cloche). La lecture du caractère « indole » s’effectue après ajout du réactif de Kovacs : la présence d’un anneau rouge permet de conclure à « indole + ». • Isolement et identification des coliformes - Isolement des coliformes -Milieu utilisé : EMB (éosine – bleu de méthylène) Ce milieu ne contient pas d’agents sélectifs très puissants (éosine et bleu de méthylène ne font qu’inhiber partiellement la culture des Gram +) ni d’indicateur de pH. -Ensemencement Isoler classiquement à partir d’un tube de BLBVB positif ou à partir d’un bouillon contenant des coliformes présumés. - Incubation 24 à 48 h à 37°C. 2 -Lecture Genres bactériens probables Aspect obtenu E. coli Colonies de 2 à 3 mm de diamètre, plates, violet très foncé, avec très souvent un reflet métallique Klebsiella Colonies grosses de 4 à 6 mm de diamètre, convexes, roses avec un centre violet, muqueuses Citrobacter Colonies violet pâle avec un centre et un reflet métallique peu marqué Autres bacilles Gram – Petites colonies grises……. • Identification Les principaux genres appartenant aux coliformes sont : • Escherichia • Citrobacter • Klebsiella • Enterobacter Test IMViC (Indole – rouge de Méthyle – Voges Proskauer – Citrate) Ce test classique de microbiologie alimentaire ne permet pas une identification très précise mais il est relativement peu coûteux (ensemencement d’une eau peptonée, d’un Clark et Lubs et d’un Citrate de Simmons). Le tableau suivant permet de donner une conclusion approximative : Indole RM VP Citrate Genre ou espèce + (parfois – pour E. coli atypique) + – – Escherichia coli – (parfois + pour Citrobacter atypique) + – + Citrobacter – (parfois + pour Enterobacter atypique) – + + Enterobacter ou Klebsiella 3 uploads/s3/ colimetrie.pdf