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pratique quotidienne Interférences de l’hémolyse et de la lipémie sur trois mét

pratique quotidienne Interférences de l’hémolyse et de la lipémie sur trois méthodes de dosage de la bilirubine totale et conjuguée sur ADVIA 1650 Haemolysis and turbidity inﬂuence on three analysis methods of quantitative determination of total and conjugated bilirubin on ADVIA 1650 E. Gobert De Paepe1 G. Munteanu1 P.O. Schischmanoff2 D. Porquet1 1 Laboratoire de biochimie-hormonologie, Hôpital Robert Debré, Paris <elisabeth.de-paepe@rdb.aphp.fr> 2 Laboratoire de biochimie et biologie moléculaire, Hôpital Avicenne, 125 rue de Stalingrad, 93009 Bobigny Article reçu le 31 juillet 2007, accepté le 16 octobre 2007 Résumé. La prévention de l’ictère nucléaire chez le nouveau-né passe par une surveillance de la bilirubinémie dont le dosage est souvent rendu difﬁcile par l’hémolyse due aux difﬁcultés de prélèvement. Par ailleurs, la perfusion d’émulsions lipidiques provoque une turbidité des prélèvements interférant sur le dosage de la bilirubine. Trois méthodes de dosage de la bilirubine totale et conjuguée ont été étudiées sur Advia 1650 (Siemens Medical Solutions Dia- gnostics) aﬁn de trouver une méthode peu sensible à ces interférences : techni- que Synermed® (Soﬁbel), Bilirubine 2® (Siemens Medical Solutions Diagnos- tics) et Bilirubine Auto FS® (Diasys). La bilirubine totale est peu inﬂuencée par l’hémolyse quelle que soit la technique, la technique Siemens étant toute- fois la moins sensible surtout dans les valeurs basses. La bilirubine conjuguée est très sensible à l’hémolyse pour les techniques Diasys (dès 30 lmol/L soit 0,192 g/100 mL d’hémoglobine) et Synermed (dès 60 lmol/L soit 0,484 g/100 mL d’hémoglobine), la technique Siemens restant dans les normes d’acceptabilité de la SFBC. La lipémie reste sans effet sur les bilirubines totales jusqu’à 2 g/L d’Ivelip mais interfère fortement sur la bilirubine conju- guée Synermed dès 0,5 g/L d’Ivelip ; les techniques Diasys et Siemens ne sont que peu inﬂuencées. Les techniques Siemens et Diasys permettent de doser la bilirubine totale et conjuguée malgré la présence d’une hémolyse et d’une lipémie importantes, la technique Siemens étant la moins sensible à ces deux interférents. Mots clés : bilirubine totale, bilirubine conjuguée, interférence, hémolyse, lipémie Abstract. Plasma bilirubin testing is crucial to prevent the occurrence of neonatal kernicterus. Haemolysis may occur during sampling and interfere with bilirubin determination. Moreover, lipidic infusions may induce plasma lipemia and also interfere with bilirubin measurement. We evaluated the inter- ference of haemolysis and lipemia with three methods of total and direct bilirubin measurement adaptated on an Advia 1650 analyser (Siemens Medical Solutions Diagnostics) : Synermed® (Soﬁbel), Bilirubin 2® (Siemens) and Bilirubin Auto FS® (Diasys). The measurement of total bilirubin was little affected by haemolysis with all three methods. The Bilirubin 2® (Siemens) method was the less sensitive to haemolysis even at low bilirubin levels. The measurement of conjugated bilirubin was signiﬁcantly altered by low heamo- globin concentrations for Bilirubin Auto FS® (30 lM or 0,192 g/100 mL hae- moglobin) and for Synermed (60 lM or 0,484 g/100 mL haemoglobin). In marked contrast, we found no haemoglobin interference with the Direct Biliru- abc Ann Biol Clin 2008 ; 66 (2) : 175-82 doi: 10.1684/abc.2008.0198 Ann Biol Clin, vol. 66, n° 2, mars-avril 2008 175 bin 2® reagent which complied with the method validation criteria from the French Society for Biological Chemistry. The lipemia up to 2 g/L of Ivelip® did not affect neither the measurement of total bilirubin for all three methods nor the measurement of conjugated bilirubin with the Diasys and Siemens reagents. However, we observed a strong interference starting at 0,5 g/L of Ivelip® with the Synermed reagent. Our data suggest that both Siemens and Diasys methods allow to measure accurately total and conjugated bilirubin in hemolytic and lipemic samples, nevertheless, the Siemens methodology is less affected by these interferences. Key words: total bilirubin, conjugated bilirubin, interference, haemolysis, lipemia L’ictère néonatal est présent chez 60 % des nouveau-nés à terme et en bonne santé [1]. Dans la plupart des cas cet ictère à bilirubine non conjuguée reste modéré, atteint un maximum entre le troisième et le sixième jour de vie pour régresser ensuite. Dans certains cas d’hémolyse (incompa- tibilité ABO ou Rhésus, déﬁcit en G6PD, microsphérocy- tose, elliptocytose) l’ictère est beaucoup plus important et plus prolongé. Un ictère important peut aussi être observé en cas d’allaitement maternel, d’hypothyroïdie et chez les prématurés. Le risque principal des ictères à bilirubine non conjuguée est la survenue d’une encéphalopathie ou ictère nucléaire aux conséquences graves. Rare en période néonatale, l’ictère à bilirubine conjuguée est fréquent lors des nutritions parentérales au long cours et lors des hépati- tes. La prise en charge de l’ictère néonatal vise à maintenir la bilirubine totale en dessous d’un seuil critique se situant vers 335 à 350 lmol/L [2, 3] par la mise en route éven- tuelle d’un traitement par photothérapie. Le dosage san- guin de la bilirubine est réalisé avant, pendant et après photothérapie. Les difﬁcultés de prélèvement des nouveau-nés et plus encore s’ils sont prématurés, provo- quent souvent une hémolyse des prélèvements ; chez les enfants nourris par alimentation parentérale les perfusions d’Ivelip®20 % (Clinitec Parenteral) entraînent une lipémie du plasma. L’hémolyse et la lipémie des échantillons per- turbent les résultats des dosages de bilirubine totale et conjuguée. Les automates actuels mesurent en bichroma- tisme des indices sériques qui permettent d’alerter l’utili- sateur sur l’existence d’une hémolyse (571 nm/596 nm sur l’Advia 1650) ou d’une lipémie (658 nm/694 nm) qui pourraient fausser les dosages. Si l’emploi des indices sériques permet d’éviter des résultats faux il ne permet pas le dosage de la bilirubine en présence d’hémolyse ou de lipémie. Il est donc essentiel d’utiliser une technique très peu sensible à ces interférences. Nous avons testé les techniques Siemens Medical Solu- tions Diagnostics et Diasys annoncées peu sensibles aux interférences en comparaison avec la technique Synermed actuellement utilisée dans notre laboratoire sur Advia 1650 (Siemens Medical Solutions Diagnostics). Matériel et méthode Cette étude a été réalisée sur l’analyseur multiparamétri- que de biochimie Advia 1650® (Siemens Medical Solu- tions Diagnostics®). Principe Trois techniques ont été étudiées : Bilirubine totale et conjuguée proche infrarouge Synermed® (Fumouze Diagnostics-Soﬁbel, Levallois Perret, France), Bilirubine totale 2® et Bilirubine conjuguée 2® (Siemens Medical Solutions Diagnostics, Puteaux, France) et Bilirubine Auto Totale FS® et Directe FS® (Diasys, Condom, France). Un résumé est présenté dans le tableau 1. Le dosage de la bilirubine totale Synermed utilise une oxydation en milieu acide de la bilirubine libre et conju- guée en présence de diméthylsulfoxide (DMSO), d’acide chlorhydrique et d’un catalyseur transporteur d’électrons dénommé KHC3, en un chromophore bleu-vert, la cholé- cyanine, dont l’absorbance est mesurée en bichromatisme (k principale : 694 nm, k secondaire : 805 nm). Une aug- mentation de la concentration en acide chlorhydrique et en catalyseur et une diminution de la concentration de DMSO permettent de ne doser que la bilirubine conju- guée. Le dosage de la bilirubine totale Siemens Medical Solu- tions Diagnostics utilise une oxydation vanadique de la bilirubine en biliverdine à pH 3, en tampon citrate en présence de thiourée permettant la solubilisation de la bili- rubine non conjuguée. L’utilisation d’EDTA disodique permet de diminuer l’absorbance du blanc réactif et favo- rise l’oxydation de la bilirubine non conjuguée. La dimi- pratique quotidienne Ann Biol Clin, vol. 66, n° 2, mars-avril 2008 176 nution de l’absorbance est mesurée en bichromatisme (k principale : 451 nm, k secondaire : 545 nm). La bilirubine conjuguée est dosée en l’absence de thiourée, en tampon tartrate en présence d’hydroxylamine qui absorbe l’excès de métavanadate de sodium et d’acide hydroxyéthane–di- phosphonique, un agent chélatant qui diminue l’absor- bance du blanc réactif et favorise l’oxydation de la biliru- bine conjuguée. La lecture est faite aux mêmes longueurs d’onde. Le dosage de la bilirubine totale Diasys FS utilise la for- mation en milieu acide chlorhydrique (30 mmol/L) d’un azocomposé, la dichloroazorubine rouge, en présence de 2,4-dichloraniline diazotée et de détergents. L’augmenta- tion de l’absorbance est mesurée en bichromatisme (k principale : 545nm, k secondaire : 658 nm). Le dosage de la bilirubine conjuguée se fait sans détergent, en présence d’acide sulfanilique, de 2,4-dichloraniline diazotée, d’EDTA disodique et en augmentant la concentration d’acide chlorhydrique (130 mmol/L). Prélèvements Le sang est recueilli sur héparinate de lithium, sans gel (S-Monovettes 1,2 mL et microvettes 0,5 mL Sarstedt®), centrifugé à 4 000 tr/min pendant huit minutes. L’auto- mate travaille directement sur le tube primaire pour les tubes de 1,2 mL ou sur plasma décanté en microgodets pour les microvettes. L’analyse est faite immédiatement après la centrifugation. Etude des paramètres des dosages Le protocole rédigé par la commission « Validation de techniques » de la Société française de biologie clinique (SFBC) et les recommandations de celle-ci pour les coef- ﬁcients de variation (CV) ont servi de base à cette étude. Néanmoins notre but étant l’étude des interférences, la validation complète des techniques n’a pas été réalisée. Le laboratoire de biochimie de l’hôpital Robert Debré a étu- dié les trois techniques, le laboratoire de biochimie de l’hôpital d’Avicenne utilisateur de la technique Diasys a étudié les caractéristiques de celle-ci. L’essai de répétabilité a été réalisé sur deux niveaux de concentration (bas et élevé), à partir de pools de plasmas de patients, en réalisant uploads/Sante/ interferences-de-lhemolyse-et-de-la-lipemie-sur-trois-methodes-de-dosage-de-la-bilirubine-totale-et-conjuguee-sur-advia.pdf