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Patrice Crété Laboratoire de Génétique et de Biophysique des plantes UMR6191,Fa

Patrice Crété Laboratoire de Génétique et de Biophysique des plantes UMR6191,Faculté des Sciences de Luminy crete@luminy.univ-mrs.fr La transgenèse végétale Novembre 2009 Biotechnologie Ensemble de techniques biologiques, provenant de la recherche fondamentale, qui sont appliquées à la recherche et au développement de produits. La biotechnologie recouvre l'emploi de l'ADN recombinant, la fusion cellulaire et les nouveaux procédés biotechnologiques. La biotechnologie végétale est un domaine précis dans lequel des techniques scientifiques servent à mettre au point de nouvelles variétés de plante. la transgenèse végétale 1 Objectifs de la biotechnologie végétale * Produire de la biomasse cellules, tissus, organes, plantes - Utilisations variables: bio production, multiplication * Modifier le génotype d’une plante -introduire un nouveau caractère -supprimer un caractère préexistant la transgenèse végétale 2 La plupart des expériences de transgenèse végétale nécessite la culture in vitro 1756: Henri Duhamel du Monceau, des bourgeons apparaissent entre le bois et le cortex quand on enlève l’écorce 1839: Scleiden et Schwann: La théorie cellulaire: la cellule végétale est capable d’autonomie et est totipotente Totipotence: aptitude de la cellule végétale à exprimer la totalité des potentialités du génome pour donner un organisme entier Cette totipotentialité cellulaire s'accompagne d'une possibilité de multiplication indéfinie que l'on peut observer dans les zones de croissance de la plante : les méristèmes, cellules restant dans un état de dédifférenciation permanent. La culture in vitro la transgenèse végétale 3 Mise au point de la culture in vitro à partir : - d’explant avec cellule méristématique (non différenciée, juvénile) Enchaînement de mitoses donne - une callogenèse - une organogenèse - une embryogenèse somatique - de tout type de tissus sans cellule méristématiques ( dédifférenciation-redifférenciation) La culture in vitro : les explants la transgenèse végétale 4 La culture in vitro : les régulateurs de croissance tryptophane AIA (photosensible) Les AUXINES dérive d’un acide aminé: le tryptophane, exp: l’acide indole acétique Stimulation de l'élongation cellulaire, la division cellulaire et de l’organogenèse (rhyzogenèse). La synthèse de l'auxine s'effectue dans les apex des tiges, dans les méristèmes et dans les jeunes feuilles des bourgeons terminaux. Le transport de l'auxine s'effectue de façon polarisée, de l'apex vers la base dans la tige. la transgenèse végétale 5 LES CYTOKININES Stimule la division cellulaire (nom en relation avec cytokinèse ) et l’organogenèse (caulogenèse: bourgeon) Synthèse dans les racines puis migrent dans la plante via la sève brute Dérivent d’une base de l’ADN: l’adénosine la transgenèse végétale 6 Rôle des auxines et des cytokinines dans l’organogenèse Le rapport auxines / cytokinines détermine le devenir des tissus en culture En concentrations égales->division de cellules indifférenciées, callogenèse Auxine -> formation de racines Cytokinines -> bourgeons la transgenèse végétale 7 Indole Butyric Acid (IBA) La transgenèse végétale La galle du collet (crown gall ou « cancer des plantes » ) Viticulture, sylviculture problèmes Certaines bactéries infectent les cellules végétales et provoquent des tumeurs ou proliférations cellulaires chez les plantes infectées la transgenèse végétale 8 Braun montre en 1943 que les cellules de la tumeur peuvent se multiplier indéfiniment en absence de bactéries et en absence de substances de croissance (auxines, cytokinines ). Prélèvement de cellules de la tumeurs et mise en culture in vitro en absence d’auxines et de cytokinines Productions de cals Propriétés des cellules de la tumeurs la transgenèse végétale 9 Braun montre en 1943 que la tumeur peut croître indéfiniment en absence de bactéries puis en absence de substances de croissance (auxines, cytokinines ). la transgenèse végétale 10 2) Croissance indépendante d’ajout d’hormones Les agrobactéries hébergent de très grands plasmides nécessaires à la formation des tumeurs A. Tumefaciens -> plasmide Ti Organisation du plasmide Ti (Tumor inducing) ADN circulaire extrachromosomique, autonomie de réplication, plusieurs exemplaires/Cel Bordures, séquences consensus la transgenèse végétale 11 Les plasmides Ti -1 ou 2 ADN-T (ADN Transféré) -L’ADN-T porte des gènes qui permettent la synthèse d’auxines et de cytokinines et la synthèse et la sécrétion d’opines Les cellules transformées (avec ADN-T) produisent des auxines et des cytokinines d’où le développement de tumeurs la transgenèse végétale 12 Plasmide Ti à octopine Les gènes nécessaires au transfert du T-DNA sont portés par la zone vir (virulence) des plasmides Ti la transgenèse végétale 13 Dans le plasmide Ti, en dehors de la région de transfert et de la région vir Gènes impliqués dans les fonctions de : - réplication du plasmide (région ori) - de transfert conjugatif (région tar) Il y aurait 195 ORF: - 20 gènes impliqués dans la conjugaison - 3 gènes de réplication - 7 gènes de modification du plasmide - 22 gènes de pathogenèse - 38 gènes assurant le transfert de l’ADN-T - 24 gènes impliqués dans le métabolisme des opines - 12 gènes assurant des fonctions diverses telles que le transport de ribose, le chimiotactisme… - 84 séquences non répertoriées la transgenèse végétale 14 La transcription des gènes vir est induite par des composés phénoliques émis par les cellules blessées ex: acétosyringone Les inducteurs des gènes de virulence Egalement induction par monosaccharides (arabinose, fucose, xylose constituants de la paroi …) Induction par pH extracellulaire très bas (5 - 5,5) inhibition de la croissance bactérienne donc favorise le transfert de l’ADN-T la transgenèse végétale 15 Reconnaissance cellules végétales - bactéries composés phénoliques, monosaccharides Blessure Chimiotactisme, déplacement de la bactérie via son flagelle Fixation à la cellule végétale, récepteurs spécifiques à identifier Synthèse de filaments de cellulose Induction des gènes vir la transgenèse végétale 16 Modèle d’activation des gènes de virulence virA faible expression constitutive, chimiorécepteur membranaire et kinase VirG, faible expression constitutive, interagit avec boites vir dans région promotrice des opérons (12pb conservées), autorégulation de virG chvE nécessaire dans l’induction par les sucres monosaccharides autophosphorylation Souche hypervirulente = forte quantité de virG (quand croissance libre, peu de virG) la transgenèse végétale 17 Modèle de synthèse de l’ADN-T VIR D2 VIR D2 coupures Ici coupure simple brin d’où intermédiaire ADN-T simple brin, on peut avoir des coupures double brin et un intermédiaire ADN-T double brin, dépend des souches la transgenèse végétale 18 Vir D2 Vir D2 Vir D2 Vir D2 Vir D2 Vir D2 Modèle de synthèse de l’ADN-T VirD2 et VirE2 contiennent un signal de localisation nucléaire (NLS) Transfert dans le cytoplasme de la cellule, apparenté à une conjugaison de type bactérien Agrobactérie Membrane cellulaire cytosol Cellule végétale la transgenèse végétale 19 Modèle d’intégration de l’ADN-T dans l’ADN végétal Recombinaison non homologue ! Utilise la machinerie cellulaire 3’ 3’ = délétion de l’ADN génomique la transgenèse végétale 20 Intégration aléatoire dans le génome, plutôt régions transcrites Possibilité d’avoir plusieurs copies, nature des tissus, de la souche Tout les gènes de l’agrobactérie possèdent les éléments de régulation de la transcription, Pol II En plus intégration de l’ADN-T dans génome de champignons, levure et en 2002 dans cellules humaines en culture par contact avec des agrobactéries la transgenèse végétale 21 la transgenèse végétale 22 La transformation génétique comme outil de biotechnologie Système de transformation binaire R Structure d’un transgène p35S gène à exprimer pNos gène de sélection BG BD ADN-T la transgenèse végétale 23 Les étapes de la transformation génétique du tabac BD BG la transgenèse végétale 24 transformation Cellules Disques foliaires la transgenèse végétale 25 ou OGM ou PGM Transmission de l’ADN-T à la génération d’après Intégration aléatoire dans le génome Applications de la transgenèse végétale 1) Etude des promoteurs 2) Etude de l’adressage des protéines 3) Recherche de la fonction des gènes -par complémentation ou par modification de leur expression (sur- expression ou sous-expression (RNAi) ) -Par étude de mutants ‘perte de fonction’, production de mutants d’insertion Applications fondamentales la transgenèse végétale 26 Le gène marqueur de la B-glucuronidase de E.coli (GUS) 1) Étude de l’activité d’un promoteur BLANC BLEU la transgenèse végétale 27 1) Étude de l’activité d’un promoteur - Détails de la construction - Observations Promoteur A Promoteur B la transgenèse végétale 28 Marquage des noyaux avec une fusion NLS-GFP dans une plante transgénique GFP; Green fluorescent protein (Aequora victoria), protéine avec chromophore Émission à 509 nm Absorbtion à 395 nm 2) Etude de l’adressage des protéines la transgenèse végétale 29 3) Production de banques de mutants d’Arabidopsis thaliana par insertions d’ADN de Transfert la transgenèse végétale 30 3) Production de banque de mutants d’insertion d’ADN de transfert Plusieurs dizaines de milliers de transformants indépendants, donc d’insertions situées à différents emplacements dans le génome (0,1 à 3%) En général, obtention de mutants dits perte de fonction, mutation récessive la transgenèse végétale 31 la transgenèse végétale 32 CTGCAGACTTGAGTACAAGGGTGATGATGCGGACATTCTATCTGCTTA……... Gène X Transgenèse, insertion au hasard du T-DNA T-DNA Gene X Séquençage de la région flanquant une des bordures du T-DNA Localisation du T-DNA dans le gène X grâce à la connaissance de la séquence complète du génome Gene X BG BD Production de banque de mutants par insertion d’ADN de transfert AATCGTAGTACTAGAT Exemple d’une insertion dans un gène BD Gène X la transgenèse végétale 33 FST : Flanking Sequence Tags Séquençage des régions flanquantes de l’ADN de transfert LB: Left Border ADN génomique la transgenèse végétale 34 acaaatttct acagaggatg atattcaatc cacggttcac ccaaaccgat tttataaaat 61 ttattattaa atctttttta attgttaaat tggtttaaat ctgaactctg tttacttaca 121 ttgattaaaa ttctaaacca tcataagtaa aaaataatat uploads/Science et Technologie/ la-transgenese-vegetale.pdf