Remerciez-le!

Remerciez @Admin pour avoir partagé cet document gratuitement, de la manière la plus simple, en partageant sur les réseaux sociaux.

DFGSM2 – BIOLOGIE CELLULAIRE ET MOLECULAIRE E.D 1 : communications cellulaires

DFGSM2 – BIOLOGIE CELLULAIRE ET MOLECULAIRE E.D 1 : communications cellulaires Vendredi 27/09/2013 Présentation orale : les 2 exercices sont à préparer par tous et ils seront présentés oralement (tableau, transparents ou power point) par les étudiants des sous-groupes correspondants. La présentation orale sera faite par l’ensemble du groupe en se répartissant les rôles. La composition des groupes de préparation sera consultable sur le site du département à la rubrique « PCEM2 / planning » ou sur MonUPMC (dans cours / sakai / accéder à sakai / PCEM2 / cours / biologie / ED: supports et infos). Afin de préparer cette présentation orale, vous pouvez contacter et prendre rendez-vous avec l’enseignant en charge de votre groupe. La répartition pour cette séance est la suivante : Groupes Salles Enseignants emails 1 et 7 203 Olivier Lascols olivier.lascols@upmc.fr 2 et 8 205 Filomena Conti filomena.conti@sat.aphp.fr 3 et 9 207 Elodie Bouaziz elodie.bouaziz@psl.aphp.fr 4 et 10 208 Johanne Le Beyec-Le Bihan johanne.lebihan@psl.aphp.fr 5 et 11 210 Dominique Rainteau dominique.rainteau@upmc.fr 6 et 12 212 Corinne Vigouroux corinne.vigouroux@inserm.fr Exercice 1 : étude de la transduction du signal PDGF Le PDGF (facteur de croissance dérivé des plaquettes) stimule la prolifération de nombreux types de cellules en se liant à des récepteurs membranaires. Ceux-ci sont classés dans les récepteurs à activité enzymatique. La dérégulation de la transmission de ce signal peut conduire au développement de diverses pathologies notamment de nature cancéreuse. A travers les expérimentations suivantes nous allons essayer de préciser le mode de transduction du signal PDGF de l’extérieur à l’intérieur de la cellule. 1. Liaison du PDGF à son récepteur Les tests de liaison du PDGF sont effectués sur des cellules en culture en présence de doses croissantes d’I125-PDFG (0 à 5,5 ng/ml) en absence (courbe continue) ou en présence d’un excès de ligand « froid » (200 ng/ml non radioactif)(courbe en pointillés) dans un milieu tamponné à pH 7,4 approprié. Au terme de 4h d’incubation à 4°C, les cellules sont lavées puis collectées pour mesurer la radioactivité liée. Les résultats présentés dans la figure ci-contre sont rapportés en molécules d’I125-PDFG liées par cellule en fonction de la concentration d’I125-PDGF dans le milieu. a. Pourquoi, au regard des résultats de liaison en présence du PDGF radioiodé seul, pouvez-vous affirmer que cette liaison totale ne correspond pas uniquement à une liaison spécifique de ce facteur de croissance sur les cellules ? b. Que détermine-t-on en présence d’un excès de ligand « froid » (courbe pointillée) ? DFGSM2 : ED1 communication cellulaire 2/6 c. Comment obtenir à partir de ces tests de liaison dans les 2 conditions (en présence ou en absence d’un excès de PDGF froid) la courbe de la composante spécifique ? 2. Activation du récepteur au PDGF Les récepteurs membranaires au PDGF sont purifiés en 2 étapes : des préparations membranaires sont solubilisées en présence d’un détergent puis le solubilisat est soumis à une chromatographie d’affinité. Cette dernière utilise une colonne de billes de sépharose sur lesquelles ont été fixés des anticorps anti- récepteur de PDGF (PDGFR). Après élution des composants liés sur la colonne d’affinité, les échantillons sont mis en présence ou non de PDGF (100 ng/ml) puis analysés par western blot avec des anticorps anti-PDGFR ou des anticorps anti- PY (anti-phosphotyrosine). a. Rappeler le principe et les 3 étapes composant cette analyse en western blot. b. Interprétez les résultats d’immmunoblots obtenus avec les 2 types d’anticorps sur le schéma ci-contre. 3. Mécanisme d’activation des récepteurs au PDGF Les expériences précédentes vous ont permis de caractériser l’effet du PDGF sur son récepteur, mais vous souhaiteriez préciser la configuration des récepteurs favorables à cette étape. Pour ce faire, vous avez construit des ADNc codant trois formes d’un récepteur PDGF (figure A): - la forme normale, dotée d’un domaine kinase actif et de trois sites de phosphorylation Y (1). - une version longue, qui porte une mutation ponctuelle inactivatrice dans le domaine kinase mais garde les trois sites de phosphorylation Y (2). - une version courte, qui possède un domaine kinase actif mais est dépourvue de sites de phosphorylation (3). Vous faites exprimer ces ADNc seuls (1, 2, 3) et en combinaison (1+2, 1+3, 2+3) dans une lignée cellulaire qui n’exprime pas par elle-même ce récepteur (les techniques de vecteur d’expression et de transfection cellulaire seront abordées dans un autre ED). Vous cassez ensuite les cellules et ajoutez le ligand du récepteur en présence d’ATP radioactif marqué en γ. Enfin, vous immunoprécipitez les récepteurs avec un anticorps anti-EGFR et analysez leurs niveaux d’expression en colorant les protéines au bleu de Coomassie (figure B) et leur phosphorylation par autoradiographie (figure C). Types de récepteurs → → → → exprimés DFGSM2 : ED1 communication cellulaire 3/6 a. Pouvez-vous formuler les hypothèses que les chercheurs ont testées concernant le mécanisme de transduction au niveau du PDGFR ? b. Les résultats expérimentaux obtenus vous permettent-ils de conclure sur ce mécanisme ? Justifiez votre réponse en analysant puits par puits les résultats obtenus : - Au niveau du gel coloré par le bleu de Coomassie. - Au niveau du gel présentant les protéines radioactives. 4. Les relais intracellulaires du signal PDGF a. Lors de l’activation par le PDGF, certaines cellules peuvent répondre par une production d’IP3 intracellulaire (inositol tri-phosphate). Cette synthèse résulte de l’activation d’une phospholipase Cγ (PLCγ). Afin de déterminer la position de cet enzyme dans la voie de transduction du signal, nous réalisons sur les extraits solubilisés traités ou non par le PDGF (100 ng/ml) pendant 60 min, une immunoprécipitation avec un anticorps anti- PDGFR. Les immunoprécipités sont ensuite testés pour leur activité PLC en mesurant l’apparition d’IP3. La cinétique correspondante est présenté dans la figure ci-contre : extraits traités par le PDGF ; extraits non traités par le PDGF. - Commentez la cinétique d’activation. - Ces résultats permettent-ils de préciser la position de la PLC dans la voie de transduction du signal PDGF ? Justifiez votre réponse. - Quel type d’expérience permettrait de déterminer le mode de recrutement de cet enzyme dans la voie lors de l’activation de la transduction ? b. D’autres relais de la voie de signalisation PDGF ont été identifiés tels que la PI3K (Phosphatidyl Inositol 3 Kinase), GAP (GTPase Activating Protein), PTP (PhosphoTyrosine Phosphatase) selon le schéma ci-contre. - Est-ce que ces relais vont s’associer de façon aléatoire sur les différents résidus tyrosines phosphorylés présente sur le récepteur ou est-ce que chacun s’associe par une position unique ? Vous justifierez votre réponse. c. La PLCγ présente différents domaines, dont un domaine SH3. Quelle est la spécificité de ce domaine et son rôle dans la transduction du signal PDGF ? Time (min) DFGSM2 : ED1 communication cellulaire 4/6 Exercice 2 : Récepteur couplé aux protéines G et pathologies 1. Maladie génétique liée au récepteur LH Un diagnostic de génétique moléculaire est réalisé pour un patient présentant une puberté précoce. Une mutation dans le gène codant le récepteur à la LH (hormone lutéinisante) est observée. Elle se traduit au codon 457 par la substitution d’un résidu leucine par un résidu arginine (L457R) dans la 3ème hélice transmembranaire du récepteur (figure ci-contre). Afin de confirmer ce résultat et d’étudier le mode de transmission familial de ce variant génétique, une étude par PCR-RFLP est pratiquée. On établit en fait la carte de restriction d’un produit de PCR amplifié à partir de l’exon 11 du gène du récepteur LH. L’amplification par PCR d’un fragment de cet exon conduit à l’obtention d’un fragment de 166 paires de bases (pb) (ND : non digéré). Ce fragment est soumis ensuite à une digestion par l’enzyme Mnl1 (D) qui génère différents types de fragments Ces fragments sont séparés par électrophorèse en gel d’agarose en présence de Bet (bromure d’éthidium) et visualisés par la fluorescence sous UV du Bet incorporé. Pour l’ADN d’un sujet normal, il existe 1 site de restriction pour Mnl1 générant 2 fragments de 129 et 37 pb. La figure ci-contre présente les résultats obtenus avec ou sans digestion pour le patient, son père et sa mère (ND: non digéré, D:digéré). Il est à noter que les 2 parents ne présentent pas de pathologie. a. A partir de quels types de prélèvements peut-on réaliser ce type d’examen génétique moléculaire ? b. Interpréter les résultats obtenus pour les 3 sujets testés. Pouvez-vous donner le mode de transmission de la mutation ? c. Une étude fonctionnelle est effectuée afin d’évaluer la relation entre le génotype muté et le phénotype de puberté précoce. Pour cela, des cellules humaines embryonnaires en culture sont transfectées par l’ADNc codant soit le récepteur LH sauvage (hLHR-wt) soit celui porteur de la mutation (hLHR(L457R)). Les tests de liaison de la hCG (gonadotrophine chorionique humaine, analogue de la LH) ne montrent pas de différence des caractéristiques de liaison du ligand aux différents récepteurs. Ces cellules sont ensuite mises en présence de concentration croissante d’hCG (0 à 1000 ng/ml) afin de déterminer la capacité de transduction du signal en terme de synthèse d’AMPc (AMP cyclique) dans les 2 modèles cellulaires (figure ci-contre). - Interprétez les résultats pour les uploads/Management/e-d-1-communications-cellulaires.pdf