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GENETIQUE BACTERIENNE 2 Introduction A. Les mutations I- Définition : II- Les d

GENETIQUE BACTERIENNE 2 Introduction A. Les mutations I- Définition : II- Les différents types de mutation : B. Les transferts génétiques I- Transformation : Découverte de la compétence naturelle chez les bactéries, Transformation naturelle Transformation artificielle II-Conjugaison : F+ conjugaison ; Hfr conjugaison ; conjugaison interrompue ; sexduction ; résistance plasmide conjugaison III- Transduction : transduction généralisée et transduction spécialisée IV-Recombinaison: 3 Introduction La génétique: Science de la variation et de l'hérédité: étude chez les organismes doués de reproduction sexuée, du croisement ou hybridation entre races ou variétés de la même espèce. Les bactéries: Sont des êtres unicellulaires qui possèdent les éléments essentiels à la vie cellulaire. Leur taille varie de 1 à 10 microns (μm). Elles ne sont donc visibles qu'au microscope optique (×103 ) ou au microscope électronique (×106). Est-ce que les bactéries sont concernées par l’analyse génétique ? 4 L’absence visible de différences morphologiques : liée à la taille des bactéries (de l’ordre de quelques μm); L’absence de spécialisation de la cellule : une cellule bactérienne donne naissance à deux bactéries puis à 1010 ,toutes les bactéries sont identiques entre elles et identiques à la cellule mère. On ne distingue pas de forme germinale ou somatique comme c’est le cas chez les cellules supérieures. Au départ, les bactéries étaient considérées comme peu favorables à l'analyse génétique pour 2 raisons principales: 5 Cependant, les bactéries peuvent subir des variations qui seront transmissibles au cours des générations. Exemple de variations bactériennes -Aspect de la colonie -Dépigmentation de la culture -Perte de la virulence (capsule) chez le pneumocoque -Caractère de fermentation (lactose) -Croissance sur milieu minimum (mutant reverse His+) -Acquisition de la résistance à un antibiotique 6 Ces variations touchent le matériel génétique de la bactérie (ADN): La bactérie possède généralement un seul chromosome circulaire de taille très variable; Le chromosome bactérien est de 1 mm de long (1000 fois la longueur de la bactérie) et 3 à 5 nanomètres de large: il est surenroulée dans le cytoplasme grâce à l'action des topoisomérases (au nombre de 4 chez les bactéries). Plusieurs espèces bactériennes ont leur génome séquencé: E coli: 4700 kb Pseudomonas aeruginosa: 5900kb  Cet ADN peut être l'objet de variations qui se traduisent par l'apparition de différences héréditaires dans les structures et/ou les fonctions permanentes des bactéries 7 Les variations génétiques ou génotypiques résultent d'une: Mutation, Transformation, Conjugaison, L'acquisition d'un plasmide, Transduction 8 A- Mutations I. Définition: La mutation se définit comme une modification héréditaire du matériel génétique (génotype). Elle peut être spontanée ou induite par des mutagènes. La majorité des mutations se produisent de manière spontanée, ce qui veut dire que ce sont des évènements statistiquement aléatoires et imprévisibles. Les mutations spontanées ont lieu à une faible fréquence: une cellule parmi 105-108. Donc, si un nombre élevé de mutants est nécessaire pour des analyses génétiques, les mutations doivent être induites. L’induction de mutations est accomplie en traitant les cellules avec des mutagènes. La production de mutations à travers l’exposition à des mutagènes est appelée mutagénèse et l’organisme est dit mutagénisé. 9 10 II- Les différents types de mutation Toutes les mutations proviennent de modifications dans la séquence nucléotidique de l’ADN ou de délétions d’insertions ou de réarrangements des séquences d’ADN. II-1- Substitution de base: Le type le plus simple de mutations est la substitution de base, où une paire de nucléotides dans une molécule d’ADN double-brin est remplacée par une paire différente. Mutation de transition: une substitution de base qui remplace une base pyrimidine par une autre ou qui remplace une base purine par une autre. Mutation de transversion: une substitution de base qui remplace une pyrimidine par une purine ou une purine par une pyrimidine. 11 II-3- Effets des mutations dans les régions codant des protéines Mutations faux-sens: remplacement d’un acide aminé par un autre. Ceci peut altérer les propriétés biologiques de la protéine. Effet des substitutions de bases: II-2- Insertion et délétions Substitutions synonymes ou silencieuses: pas de changement phynotypique Mutation non sens: une substitution de base qui crée un nouveau codon stop UAA, UAG ou UGA. Obtention d’une protéine tronqué. 12 E6V β-globine (substitution de paire de bases A-T en T- A): β-globine défectueuse. formation de longs cristaux d’hémoglobine polymérisant en filaments de hauts PM / globules rouges déformés Exemple: 13 Effet des délétions / insertions: Généralement, l’insertion et la délétion conduisent à des décalages du cadre de lecture par le ribosome, et donc altèrent tous les acides aminés en aval du site de mutation. Les mutations qui décalent le cadre de lecture des codons dans l’ARNm sont appelées mutations de décalage de cadre de lecture. Un type fréquent de mutation de décalage de cadre de lecture est l’addition ou la délétion d’une seule base. Exemple: Leu Leu Leu Leu CUG CUG CUG CUG CUG CAU GCU GCU G Leu His Ala Ala 14 B- Les transferts génétiques I- Transformation Découvert par Griffith en 1928, le phénomène de transformation n’a été compris qu’en 1944 à la suite des expériences d’Avery, MacLeod et MacCarty. La transformation: est un processus par lequel l’ADN étranger est incorporé par une cellule bactérienne réceptrice. 15 15 1. Découverte de la compétence naturelle (Griffith 1928) Facteur à partir de souche (S) tuée à la chaleur: responsable de la conversion de (R) en (S) Streptococcus pneumoniae Souche (S) capsulée: virulente Souche (R) non capsulée: non pathogène 16 -Injection de pneumocoques (S): septicémie mortelle - Injection de pneumocoques (S) tués à la chaleur: ne provoque pas la mort de la souris - Injection de pneumocoques (R) : ne provoque pas la mort de la souris - L’injection d’un mélange: pneumocoques (S) tués à la chaleur + pneumocoques (R): provoque la mort de la souris Substances à partir des pneumocoques (S) tués à la chaleur: responsable de la transformation des bactéries (R) vivantes non capsulées en bactéries (S) capsulées et virulentes (polyholosides capsulaires?) 17 Découverte: ADN facteur transformant (Avery, McLeod, McCarty 1944) Avery et collaborateurs: - Les extraits (ne contenant pas de cellules) issus de souche (S) tuée à la chaleur: induisent la transformation. La fraction active purifiée à partir de ces extraits s’est avérée l’ADN L’ADN codant la synthèse de capsule est libéré par la souche (S) tuée à la chaleur est capturé par la souche (R) la transformant ainsi en souche (S) 18 19 2. Transformation bactérienne naturelle Certaines bactéries sont naturellement capables de capturer l’ADN (cellule compétente) à un stade particulier du cycle de croissance (état de compétence: fin de phase exponentielle) lorsqu’elles produisent une protéine spécifique appelée: facteur de compétence. Les cellules compétentes fixent +que 1000 fois l’ADN en comparant avec les cellules non compétentes  Au sein d’un genre bactérien transformable: seulement certaines souches ou espèces sont transformables  La compétence chez la plupart des bactéries transformables est régulée. Des protéines spécifiques jouent un rôle dans la capture et le traitement de l’ADN. 20 Les étapes impliquées dans la transformation naturelle sont: 1- Une bactérie donatrice meurt et se dégrade; 2- Un fragment d’ADN issu de la bactérie donatrice se fixe à des protéines de liaison au niveau de la paroi cellulaire d’une bactérie réceptrice vivante et compétente; 3- Une nucléase coupe l’ADN fixé en fragments; 4- Parfois un brin d’ADN est dégradé par une nucléase et l’autre pénètre dans la cellule réceptrice. Dans d’autres cas, l’ADN est capturé par la cellule réceptrice sous forme double brin. Après capture, l’ADN est attaché à une protéine spécifique de compétence pour échapper à la dégradation par les nucléases jusqu’à ce qu’il atteint le chromosome . 5- La protéine RecA favorise la recombinaison homologue entre le fragment d’ADN et l’ADN chromosomique de la souche réceptrice (intégration dans le génome de la souche réceptrice) 21 Compétence naturelle chez Bacillus subtilis (facilement transformable) Les cellules produisent et excrètent durant leur croissance un peptide de petite taille. L’ accumulation de ce peptide à des concentrations élevées induit les cellules pour devenir compétentes. Chez Bacillus, environ 20% des cellules deviennent compétentes et restent dans cet état pendant plusieurs heures. Par contre chez Streptococcus, 100% des cellules deviennent compétentes, mais seulement pour une période brève durant le cycle de croissance. Cellules de B. subtilis en phase stationnaire (P comK - gfp) 22 Transfert d’ADN à des bactéries très faiblement transformables naturellement (Escherichia coli et autres bactéries à Gram-): Favoriser la compétence chez E. coli: Transformation par choc thermique: Cellules traitées avec de fortes concentrations en calcium et puis incubées dans la glace pour plusieurs minutes deviennent compétentes (capables de capturer l’ADN double brin). La transformation de ces cellules compétentes est réalisée en mélangeant l’ADN plasmidique avec les cellules, incubation du mélange pendant 30 min dans la glace et par la suite un choc thermique est appliqué pendant 2 min à 42 °C pour favoriser l’entrée de l’ADN dans les cellules. Les cellules transformées sont par la suite incubées en milieu LB pendant 60 à 90 min à 37 °C pour favoriser l’établissement du plasmide et le gène de résistance aux antibiotique qu’il porte. Les cellules sont ensuite étalées sur milieu sélectif pour la propagation des cellules uploads/Management/ file-000026.pdf