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Cours 2 : Techniques d’étude des cellules Année universitaire 2015/2016 Départe

Cours 2 : Techniques d’étude des cellules Année universitaire 2015/2016 Département des Troncs Communs Sciences de la Nature Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Université Abderrahmane Mira de Bejaia 1- Méthodes d’analyse microscopique • Microscopie optique • Microscopie électronique 2- Techniques d’isolement des organites • Centrifugation différentielle • Centrifugation sur gradient de densité 3- Méthodes histochimiques ou cytochimiques • Mise en évidence des polysaccharides : réaction à l’acide périodique de Schiff (P.A.S) • Mise en évidence de l’ADN : réaction de Feulgen 4- Méthodes immunocytochimiques • Molécules fluorescentes • Enzymes ! Définition et principe : - Ensemble de techniques permettant d’obtenir une image de structures biologiques. - Une onde (photons, électrons) est envoyée sur la préparation ou émise par la préparation. Cette onde est captée par un objectif qui la concentre et par un oculaire qui crée une image observable. ! Principe et fonctionnement : - Fondée sur l’utilisation de la lumière et de lentilles optiques. - Permet l’observation d’éléments non visibles à l’œil nu. - Source lumineuse fournie par une lampe. - Concentrée par une lentille, le condenseur. - La lumière traverse le spécimen, puis une autre lentille appelée objectif grossit le spécimen. - Visualisée à travers une lentille : oculaire. Source lumineuse Condenseur Spécimen Objectif Oculaire œil ! Exemples d’observation Cellules végétales (Élodée) Cellule de la muqueuse buccale Chloroplaste Enveloppe nucléaire Nucléole Lamelle moyenne Paroi de 2 cellules ! Ces microscopes permettent d ’ o b s e r v e r d e s o b j e t s n o n préalablement colorés, par exemple des cellules vivantes. - (A) : quand des ondes lumineuses traversent des objets colorés, leur amplitude est diminuée, c’est ce qui crée l’image. - (B) : quand les ondes lumineuses traversent un objet non coloré, leur amplitude est peu changée, mais leur phase est modifiée, ce qui crée des interférences. Les effets de ces interférences sont exploités pour créer une image dans les microscopes à contraste de phase. Cellule colorée Cellule non colorée (A) Lumière incidente (B) Lumière incidente Ondes en phase Phase modifiée ! Exemples d’observation Cellules de l’épiderme d’oignon Cellule de la muqueuse buccale ! Ce microscope permet d’observer des éléments fluorescents (naturels comme la chlorophylle ou bien marqués par une sonde spécifique couplée à un fluorochrome) dans une cellule. ! L’objet est excité par une lumière de longueur d’onde (λ) définie par un filtre. ! A p r è s e x c i t a t i o n d e l’échantillon, celui-ci émet à son tour une lumière de longueur d’onde différente. ! E x e m p l e d ’ u n e m i t o s e o b s e r v é e e n u t i l i s a n t différents fluorochromes : - ADN en bleu - Tubuline en rouge - Protéine centromérique en vert. ! Ce microscope augmente la qualité de l’image en éliminant le flou. ! Le principe est de capter l’image non pas de toute l’épaisseur de l ’ o b j e t , m a i s uniquement d’un plan donné. ! Il est généralement utilisé pour faire de la m i c r o s c o p i e e n fluorescence ! E t a p e s d e l a m i t o s e observées en microscopie électronique à balayage (images en relief) et en m i c r o s c o p i e c o n f o c a l e (double marquage rouge-vert en immunofluorescence) : - Les chromosomes en rouge - Le fuseau mitotique en vert - La plaque métaphasique en jaune. Prophase Métaphase Anaphase Télophase ! Au lieu d’être éclairé, l’objet est b o m b a r d é p a r u n f a i s c e a u d’électrons. ! L’image mettra en évidence les structures plus ou moins opaques aux électrons. ! L’objet doit être préalablement coupé en tranches ultrafines, puis imprégné de sels de métaux lourds qui vont se fixer différentiellement sur les différentes structures intracellulaires et les rendre plus ou moins opaques aux électrons. Lumière Source d’électrons Condenseur Spécimen Objectif Oculaire Lentille du projecteur Image directement observée Ecran de visualisation ou film photographique Microscopie optique MET ! Cellule végétale observée au MET Chloroplaste Noyau Nucléole ! Observation du relief des structures. ! L’objet à observer n’est pas coupé, mais sa surface est recouverte d’un fil métallique d’épaisseur différentielle en fonction du relief. ! Le matériel biologique est ensuite dissout à l’acide. ! Le fil métallique est récupéré et a n a l y s é a u m i c r o s c o p e électronique. Échantillon Fil métallique Filament Réplique de métal Réplique de métal Dissolution à l’acide Réplique de métal ! Caillot sanguin observé au MEB ! L’objet à observer au microscope optique doit laisser passer les photons : - Coupe fine de l’objet (5 à 10 µm) pour être translucide. - Fixation et durcissement de l’objet pour ne pas s’autodétruire. ! Traitements appliqués à l’objet : - Fixation : dans une solution d’aldéhydes ou de sels oxygénés de métaux lourds. - Durcissement : par congélation, polymérisation ou inclusion en paraffine, nécessitant au préalable une déshydratation dans des bains d’alcool. - Coupe : au microtome. - Coloration : dépend des besoins de contraste de l’observateur, nécessite une réhydratation. - Observation : à sec ou en immersion. 1- Prélèvement de l’échantillon 2- Fixation 3- Déshydratation en bains d’alcools 4- Durcissement par inclusion en paraffine 5- Réalisation de coupes fines au microtome 6- Réhydratation en bains d’alcools 7- Coloration 8- Observation ! Les traitements appliqués à l’objet sont les mêmes qu’en microscopie optique, avec quelques spécificités : - Fixation : dans de glutaraldéhyde + acide osmique. - Durcissement : par inclusion en résine époxy. - Coupe : est effectuée par un ultramicrotome. - Colorants signalétiques : sels de métaux lourds permettant l’optimisation du contraste par absorption des électrons sur la coupe. - Colorants spécifiques : fixation de métaux sur des sondes spécifiques d’une molécule. ! Cryofracture : - Refroidissement rapide de l’échantillon dans du fréon ou de l’azote liquide. - Cryofracture par une lame qui clive le fragment en 2 parties. - Ombrage métallique : la surface de fracture constitue un moule sur lequel on dépose une couche de métal lourd. - Couche de carbone : additionnée à la couche métallique. - Faire fondre le tissu qui a servi de modèle. - Observation de la réplique de métal et de carbone au MEB. Objet Refroidissement Fréon Azote liquide Cryofracture Ombrage métallique + couche de carbone Faire fondre le tissu Réplique métallique ! Fractionnement et séparation des constituants cellulaires : - Méthode qui permet de séparer les différents composants cellulaires après destruction de la membrane plasmique. - La séparation s’effectue par centrifugation. C’est une opération de séparation mécanique basée sur l’accélération due à la pesanteur tout en augmentant la vitesse de rotation. - Les structures les plus massives se rassemblent au fond d’un tube (culot). - C’est la séparation des organites en fonction de leur taille et de leur densité par une succession de centrifugations à des temps et des accélérations croissantes. 1- Isolement des noyaux 2- Isolement des mitochondries 3- Isolement des microsomes - On peut amplifier la séparation des particules en centrifugeant dans des gradients de densité comme le saccharose ou le chlorure de caesium. Densités croissantes en saccharose (g/cm3) Avant centrifugation Après centrifugation Centrifugation de 3 h, 40 000 rpm ! Les techniques histochimiques sont basées sur des réactions biochimiques qui permettent de mettre en évidence in situ, dans les cellules ou dans les tissus, différents constituants (lipides, glucides, protéines, acides nucléiques, etc.). ! L’histochimiste cherche donc à localiser une substance donnée dans une structure histologique ! Stratégie : réaction spécifique produisant une coloration avec la substance recherchée ! Exemple de colorations : - Réaction à l’acide périodique de Schiff (P.A.S.) - Réaction de Feulgen Colorations histochimiques ! Mode opératoire pour mettre en évidence des polysaccharides grâce à la réaction à l’acide périodique de Schiff : - Etape 1 : une oxydation à l’acide périodique fait ouvrir les cycles des oses (unités monomériques des polysaccharides), générant des fonctions aldéhydes libres (-CHO) - Etape 2 : en appliquant le réactif de Schiff, on colore en rose-pourpre ou en rouge, les fonctions aldéhydes libres des oses Exemple d’une coloration PAS appliquée à un muscle squelettique ! Mode opératoire pour mettre en évidence l’ADN grâce à la réaction de Feulgen : - Etape 1 : une hydrolyse modérée par l’acide chlorhydrique (HCl) à 60°C permet de dépuriner l’ADN (élimination des bases azotées A et G) et de libérer les fonctions aldéhydes des désoxyribose (ose) - Etape 2 : le réactif de Schiff réagit alors avec les fonctions réductrices formant un précipité rouge. Donc l’ADN est coloré en rose-rouge. Nucléotide = H3PO4 + désoxyribose + 1 base azotée Nucléotide dépuriné (sans la base uploads/Litterature/ cours-2-techniques-detude-des-cellules.pdf