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Culture cellulaire Dr CHIALI F.Z Contenu de la matière: • Infrastructure et app

Culture cellulaire Dr CHIALI F.Z Contenu de la matière: • Infrastructure et appareillage • Les différents méthodes de stérilisation • Préparation des milieux • Techniques d’isolement des tissus et cellules • Conditions de cultures • Caractérisation des cellules en culture • Les facteurs mitogènes • Précautions à prendre pour empêcher toute contamination • Conférences sur les cultures: _hépatocytes_les ilots langherhans_les myosites culturels_les lymphocytes. • Application des cultures cellulaires aux cellules cancéreuses Infrastructure et appareillage • Qu’est-ce-que les infrastructure Correspond aux équipement de base qui fondent les sociétés contemporaines et entrent dans le cadre de politique d’aménagement du territoire et de service public. Pourquoi les infrastructure Ces infrastructure permettent de faciliter la vie des citoyens et de développer la communication, le transport, la santé ou encore l’éducation. En biologie, une infrastructure de recherche peut être un équipement des laboratoire et/ou des bases de données de pointe pour mener des activité de recherche et développement. Equipement L’ensemble des laboratoire disposent d’équipements permettant l’éxécution de procédures standard de culture et de traitement cellulaire incluant - Hauttes à flux laminaires - Centrifugeuses - Incubateurs • Définitions: • On appelle culture d'organe, le maintien en dehors de l'organisme, d'organes ayant conservé leur structure et leur fonction (coeur perfusé). On appelle culture de tissu, le maintien en dehors de l'organisme, des tissus de manière à conserver les fonctions spécifiques de chaque tissu. On appelle culture cellulaire, le maintien en dehors de l'organisme, des cellules non organisées en tissu mais capable de se diviser in-vitro et d'exprimer des métabolismes et des fonctions spécifiques. • Hauttes à flux laminaires Les systèmes de hottes à flux laminaires compensent Automatiquement pendant le chargement du filtre et maintiennent un débit d’air constant : ils sont parfaits pour les applications de laboratoire qui exigent la protection des échantillons. Les hottes à flux laminaires apportent Une protection exceptionnelle pour préserver l’intégrité des échantillons, avec une très grande simplicité d’utilisation pour Travailler efficacement. • Les hottes à flux laminaire présentent les caractéristiques suivantes : • Protection exceptionnelle afin de préserver l’intégrité des échantillons • Des conditions d’asepsie pour des résultats fiables • Très grande simplicité d’utilisation pour travailler efficacement • Incubateurs – Définition • Il s’agit d’incubateurs à CO2 à jaquette d’eau et chauffage de porte. • Le chauffage de porte permet d’éviter la condensation de la porte interne. • La jaquette d’eau étanche permet de minimiser l’évaporation d’eau. – Entretien • Le nettoyage de l’incubateur doit être fait impérativement 1X/mois. • Il existe un réel risque de contamination bactérienne ou de champignons due au taux d’humidité dans l’incubateur (présence du bac d’humidification) • Laboratoire de Culture Cellulaire • Définition • La distinction entre un laboratoire dit classique et une salle de culture est le fait que dans une salle de culture, il faut maintenir un degré d’asepsie. • Un laboratoire de culture cellulaire est une pièce strictement réservée aux cultures de cellules : • animales • humaines • d’insectes • C’est pourquoi, en premier lieu, il faut éviter le « trafic », c’est-à-dire une circulation importante de personnel et éviter l’accumulation de poussières. • L’introduction de hottes à flux laminaire dans ces salles a simplifié le travail à condition de les entretenir régulièrement. • La pièce de culture doit rester : • Propre • Rangée • Sans trop de « trafic » car les mouvements créent de la poussière • Eloignée des pièces où l’on manipule des bactéries • Eloignée des pièces où l’on manipule des animaux (…pas d’animaux dans les pièces de culture !) • Types d’expérimentation • Avant de démarrer une manipulation, il faut étudier les différentes étapes et voir dans quelle structure il faut travailler en évaluant les risques. • Expérimentation animale : animalerie • Culture cellulaire : salle de culture Les applications de la culture cellulaire -permettre aux chercheurs de mieux comprendre le fonctionnement des cellules. - Permettre de tester des médicaments, des produits de beauté ou encore de vérifier la toxicité de certains produits chimiques et ainsi éviter des tests sur les animaux - Permettre la production de certains vaccins dont les virus se développent à l’intèrieur des cellules - Permettre de produire des tissus tels que de la nouvelle peau pour les grands brulés. Les différentes méthodes de stérilisation • "La destruction des microorganismes ou stérilisation est indispensable lors de la préparation du matériel et des milieux destinés aux manipulations, ainsi qu'avant le lavage ou l'élimination du matériel et des milieux utilisés. Dans le premier cas, il est indispensable d'utiliser des méthodes qui ne sont pas susceptibles de gêner la prolifération ultérieure des germes étudiés : on utilise essentiellement des méthodes physiques. • Dans le deuxième cas, il sera possible d'utiliser des méthodes plus variées et à effet plus durable (méthodes physiques ou chimiques). Il faut opposer la stérilisation qui est la destruction totale des germes, à la désinfection qui est une destruction plus grossière. STÉRILISATION PAR LES MÉTHODES PHYSIQUES A - STÉRILISATION PAR LA CHALEUR • 1 - LE FLAMBAGE • Il est basé sur l'emploi du bec Bunsen. Cette méthode est utilisée pour la stérilisation extemporanée (pour utilisation immédiate) du matériel de manipulation : extrémité de l'öse, extérieur des pipettes Pasteur et pipettes graduées, col des tubes à essai, tubes contenant des milieux de culture, erlen meyers et flacons divers, étaloirs ... • Il est à noter que le bec Bunsen, réglé avec une flamme bleue, la plus chaude, crée une zone de stérilité d'un diamètre d'environ 20 cm, par ascendance de l'air de cette zone. Toutes les manipulations d'ouverture de tubes et boîtes de culture, d'ensemencement, devront être réalisées dans ce diamètre. Pour que cette zone soit effectivement stérile, les courants d'air et déplacements de personnes sont à proscrire. • 2 - LE FOUR PASTEUR • C'est un four - étuve à air chaud et sec. Il est utilisé pour la stérilisation de la verrerie vide (tubes à essai, boîtes de Pétri, tubes à culture et bouchons, pipettes Pasteur et récipients divers). • La verrerie à stériliser doit être propre et parfaitement sèche, éventuellement bouchée avec du coton et emballée dans du papier solide. Elle est alors disposée à l'intérieur du four et subit un chauffage de : • - 30 minutes à 1 heure à 170° - 180°C ou • - 2 heures à 160°C ce qui a pour but d'éviter le brunissement du coton. • Le matériel ainsi stérilisé sera laissé dans l'étuve jusqu'à son refroidissement complet, puis stocké à l'abri des poussières. Pour ces opérations, compte tenu des températures relativement élevées, il est conseillé d'utiliser le plus possible de la verrerie de type "pyrex". • 3 - L' AUTOCLAVE • C'est un appareil très performant qui est indispensable dans une unité de microbiologie. Il est utilisé pour stériliser les milieux de culture neufs ou souillés, mais peut également stériliser tout autre matériel de microbiologie. • Le chauffage a lieu sous pression de vapeur d'eau, à une température de 100° à 130°C, pendant une durée qui varie en fonction du milieu, de la température utilisée et du volume des récipients. • En milieu saturé d'humidité et sous pression, la stérilisation s'opère à des températures inférieures à celles qui sont nécessaires en milieu sec. • Le matériel à stériliser est déposé dans les paniers métalliques de l'autoclave dont on aura vérifié le niveau d'eau avant chaque opération de stérilisation. Les récipients sont préalablement bouchés avec du coton (éviter de le prendre avec les doigts -. • • utiliser de préférence une pince et recouverts de papier d'aluminium ou de papier d'emballage très résistant • Ces appareils étant relativement chers, on peut utiliser une cocotte minute spécialement achetée et réservée à cet usage. Les températures atteintes ne dépassant pas 115°C, les temps de chauffe seront prolongés de la moitié du temps nécessaire en autoclave. • 4 - AUTRES MÉTHODES Certains milieux de culture fragiles (comme les milieux au désoxycholate) ne supportant pas les températures élevées, on procède à une ébullition à 100°C. • PASTEURISATION La pasteurisation est toujours suivie d'un refroidissement rapide. Elle peut se faire en bouteilles ou en vrac. Dans le premier cas, utilisé essentiellement pour la bière, le cidre ou les jus de fruits, la boisson est mise en bouteilles; celles-ci sont capsulées puis soumises à une aspersion d'eau de plus en plus chaude, jusqu'à 65 - 75°C; elles séjournent à cette température pendant 20 à 30 minutes, puis elles sont refroidies par de l'eau de plus en plus froide. • La pasteurisation en vrac, généralement utilisée dans le cas du lait, peut se faire de deux façons : dans la pasteurisation basse, le lait est chauffé à 60 - 70°C pendant 30 minutes, ce qui nécessite des récipients de volume important; dans la pasteurisation haute, la plus utilisée en France, le lait est chauffé à 85 - 90°C pendant 20 à 30 secondes. • Cette opération se fait dans des appareils à plaques ou à tubes. L'appareil se divise en 3 parties : l'échangeur, dans lequel le lait froid se réchauffe en échangeant de la chaleur avec le lait pasteurisé; uploads/Ingenierie_Lourd/ cour-1.pdf