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Le marquage des acides nucleiques

Le marquage des acides nucléiques - Sondes des acides nucléiques Une sonde nucléotidique est un segment de nucléotides qui permet de rechercher de manière spéci ?que un fragment d ? acide nucléique que l ? on désire étudier Cette réaction sonde-fragment correspond à une réaction d ? hybridation moléculaire Les sondes d ? acides nucléiques peuvent être fabriquées sous forme de molécules simple brin ou double brin mais doivent être utilisées sous forme simple brin - Caractéristiques générales Une sonde nucléotidique peut être soit une séquence d ? ADN ou d ? ARN mais obligatoirement monobrin Sa taille est très variable oligonucléotide de - nucléotides ou à l ? opposé de plusieurs centaines de nucléotides La sonde est complémentaire et antiparallèle du fragment recherché Dans un mélange complexe o? s ? e ?ectue l ? hybridation moléculaire la sonde doit être facilement repérable gr? ce à un marquage avec un radioisotope marquage chaud mais il existe également des sondes appelées sondes froides sans marquage par un radioisotope - Obtention d ? une sonde Il existe plusieurs possibilités pour obtenir une sonde nucléotidique - Une sonde oligonucléotidique peut être fabriquée par synthèse chimique si la séquence de l ? ADN à repérer est connue Si elle est inconnue on peut étudier la protéine correspondante et remonter gr? ce au code génétique à la séquence d ? ADN Dans ce dernier cas le travail est particulièrement laborieux nombre de codons élevé pour un même acide aminé - Une sonde peut être un ADNc Une partie seulement du ADNc est utilisée après action d ? enzymes de restriction et clonage des fragments obtenus - Une sonde peut être théoriquement du mARN - L ? hybridation moléculaire avec la sonde L ? hybridation moléculaire sonde-fragment d ? ADN à repérer nécessite des conditions physicochimiques parfaites tampon pH température etc Ces conditions sont appelées la stringence Plusieurs facteurs peuvent également intervenir comme la longueur de la sonde et la complémentarité sonde- fragment avec possibil ité de mauvais appariements L ? hybridation d ? une sonde marquée atomes radioactifs radicaux uorescents ou ligands spéci ?ques sur un ADN dénaturé permet de marquer spéci ?quement tous les fragments de cet ADN dont la séquence est complémentaire de la sonde - Marquage et suivi des acides nucléiques CLe marquage est principalement employé dans toutes les techniques qui utilisent une sonde hybridation northern ? On distingue le marquage dit chaud ? utilisant des isotopes radioactifs et les marquages froids ? qui utilisent des molécules aux propriétés uorescentes luminescentes Ces dernières sont de plus en plus employées car plus pratiques - Marquage radioactif chaud ? On distingue plusieurs méthodes selon la localisation du marquage extrémités ou interne à la molécule et selon la nature de la séquence marquée simple ou double brin On dispose de plusieurs isotopes radioactifs qu ? on pourra incorporer dans la sonde On peut utiliser P S C H Le Phosphore est le radioisotope le plus utilisé Incorporé dans la sonde enzymatiquement au moyen d'un ou