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Pascal Chillet Professeur agrégé de Biochimie – Génie biologique .3. La ferment

Pascal Chillet Professeur agrégé de Biochimie – Génie biologique .3. La fermentation Collection dirigée par Joël Cnokaert – IA IPR Biochimie – Génie biologique Françoise Guillet – IGEN Biotechnologies et secteur médico-social Opérations unitaires en génie biologique b i o l o g i e t e c h n i q u e Sommaire PARTIE 1. Aspects technologiques 1. Procédés de fermentation et bioréacteurs… ……………………………………………………………………… 10 1.1. Définitions… ……………………………………………………………………………………………………………………… 10 1.2. Phases et mise à l’échelle d’une fermentation…………………………………………………………………………… 10 1.3. Différents procédés de fermentation… …………………………………………………………………………………… 12 1.4. Exemples de modèles de bioréacteurs……………………………………………………………………………………… 20 2. Les souches microbiennes et leurs milieux de culture… ………………………………………………… 20 2.1. Milieux de culture pour les fermentations industrielles……………………………………………………………… 20 2.2. Stérilisation du milieu de culture et des composés ajoutés… ……………………………………………………… 24 2.3. Souches microbiennes et préparation de l’inoculum… ……………………………………………………………… 28 3. Le bioréacteur et ses équipements… ………………………………………………………………………………… 30 3.1. Éléments implantés dans la cuve de fermentation… ………………………………………………………………… 30 3.2. La cuve… …………………………………………………………………………………………………………………………… 32 3.3. Dispositif de chauffage et de refroidissement…………………………………………………………………………… 32 3.4. Aération et agitation… ………………………………………………………………………………………………………… 32 3.5. Systèmes d’inoculation, d’addition de suppléments et de prélèvement… ……………………………………… 38 4. Suivi de la fermentation et régulation……………………………………………………………………………… 40 4.1. Rôles du suivi et de la régulation… ………………………………………………………………………………………… 40 4.2. Paramètres mesurés……………………………………………………………………………………………………………… 42 4.3. La régulation… …………………………………………………………………………………………………………………… 42 5. Extraction et purification des produits… ………………………………………………………………………… 46 5.1. Objectifs et choix des méthodes… ………………………………………………………………………………………… 46 5.2. Méthodes de séparation des particules et des micro-organismes du milieu de culture… ………………… 46 5.3. Extraction du produit…………………………………………………………………………………………………………… 48 5.4. Concentration et purification du produit… ……………………………………………………………………………… 50 PARTIE 2. Applications 1. Applications industrielles………………………………………………………………………………………………… 54 1.1. La biomasse………………………………………………………………………………………………………………………… 54 1.2. Les enzymes……………………………………………………………………………………………………………………… 54 1.3. Les métabolites… ………………………………………………………………………………………………………………… 54 1.4. Les produits recombinants… ………………………………………………………………………………………………… 56 1.5. Les produits issus des bioconversions (ou biotransformations)… ………………………………………………… 56 2. Mises en œuvre à l’échelle pilote… …………………………………………………………………………………… 58 Activité 1. Étude d’un bioréacteur 10/15 L… ………………………………………………………………………………… 59 Activité 2. Fonctionnement d’un bioréacteur 10/15 L… …………………………………………………………………… 65 Activité 3. Mesure du coefficient volumique de transfert KLa…………………………………………………………… 71 Activité 4. Suivi d’une croissance et d’une production en bioréacteur 10/15 L… ………………………………… 77 Activité 5. Production et purification d’une protéine recombinante…………………………………………………… 87 Éléments de correction des exercices et des études documentaires…………………………………… 95 Annexe 1 - Schémathèque de génie chimique…………………………………………………………………………… 106 Annexe 2 - Fiche de suivi de fabrication…………………………………………………………………………………… 107 Bibliographie……………………………………………………………………………………………………………………… 109 Crédits………………………………………………………………………………………………………………………………… 111 Partie 1 Aspects technologiques partie 1 - aspects technologiques 10 La fermentation est une technologie très ancienne de transformation et de conservation des aliments : pain, boissons alcoolisées et vinaigre. Les Sumériens fabriquaient déjà du pain et de la bière en 8000 av. J.-C., les Babyloniens maîtrisaient la fabrication du vin de palme en 5000 av. J.-C., les Égyptiens uti- lisaient les levures pour la fabrication du pain et des boissons alcoolisées en 4000 av. J.-C. et les Chinois se nourrissaient de chou fermenté dans le vin en 3000 av. J.-C. Le terme de fermentation provient du latin fervere qui signifie bouillir : au cours de certaines fermen- tations apparaissait en effet un dégagement de gaz (souvent du CO2) avec formation de mousse comme c’est le cas d’un liquide en ébullition. C’est au cours des années 1862 à 1877 que Louis Pasteur s’intéresse aux fermentations. Il étudie les ferments, la formation du vinaigre et la transfor- mation de l’alcool en acide acétique par Mycoderma aceti. C’est entre 1900 et 1940 que se développe la fer- mentation industrielle avec la production d’acétone, de butanol, de glycérol, d’acide citrique et d’acide lactique. À partir de 1940, à l’aide de programmes de sélection et de mutation de souches, diverses pro- ductions comme celles d’antibiotiques, d’acides ami- nés, de nucléotides et d’enzymes sont réalisées. C’est ensuite à partir des années 80 que le génie génétique a permis d’améliorer les souches microbiennes à fort potentiel industriel et d’explorer de nouvelles voies biochimiques. Les fermentations industrielles concernent ainsi un grand nombre de secteurs : l’alimentaire, la chimie fine, la pharmacie, l’agro-industrie et la cosmétique. 1. Procédés de fermentation et bioréacteurs 1.1. Définitions 1.1.1. La fermentation Le mot fermentation présente deux significations différentes pour les biochimistes et les microbiolo- gistes industriels. En biochimie, les fermentations sont des voies cata- boliques anaérobies au cours desquelles des compo- sés organiques servent à la fois de donneurs et d’ac- cepteurs d’électrons, la synthèse d’ATP étant réalisée par phosphorylation au niveau du substrat. En microbiologie industrielle, le terme de fermen- tation désigne l’opération unitaire qui permet de produire de la biomasse ou des produits de biocon- version par la culture de micro-organismes. Ainsi, contrairement au sens biochimique, le terme de fermentation industrielle ne se réfère pas au métabolisme du micro-organisme. Ce terme s’ap- plique en industrie pour des métabolismes aérobies et anaérobies. 1.1.2. Le bioréacteur Le bioréacteur (ou fermenteur) est une enceinte permettant d’assurer une croissance des micro-orga- nismes et une production optimale dans un environ- nement dont les paramètres physiques et chimiques de la fermentation sont contrôlés. 1.2. Phases et mise à l’échelle d’une fermentation 1.2.1. Les différentes étapes On distingue cinq étapes importantes dans tout pro- cédé de fermentation (figure 1 ) : Préparation du milieu de culture Stérilisation du milieu de culture Fermenteur d’ensemencement Bioréacteur industriel de production Contrôles et régulations : - température - aération/agitation - pH – redox - PO2 - PCO2 - anti-mousse Centrifugation ou filtration du moût de fermentation Préparation de l’inoculum Stérilisation du bioréacteur industriel de production Stérilisation du bioréacteur d’ensemencement Surnageant Biomasse Produit Produit Extraction et purification 1 Les étapes du procédé de fermentation 1. Procédés de fermentation et bioréacteurs 11 2 Bioréacteurs de laboratoire, bioréacteur pilote et bioréacteur industriel 1. Procédés de fermentation et bioréacteurs - - la fabrication du milieu de culture ; - - la stérilisation du bioréacteur et de ses équipe- ments ainsi que du milieu de culture ; - - la préparation de l’inoculum ; - - la production en bioréacteur ; - - l’extraction du produit et sa purification. 1.2.2. Processus de mise à l’échelle (ou extrapolation) : scale up On classe les bioréacteurs en fonction de leur vo- lume maximal (figure 2 ) : - - les bioréacteurs de laboratoire stérilisables à l’auto- clave jusqu’à 18 L ; partie 1 - aspects technologiques 12 - - les bioréacteurs de laboratoire stérilisables in situ jusqu’à 30 L ; - - les bioréacteurs pilotes jusqu’à 300 L ; - - les bioréacteurs industriels jusqu’à 500 000 L (500 m3). Le scale up (ou mise à l’échelle) est le transfert du procédé d’un bioréacteur de laboratoire de petit volume à celui d’un bioréacteur industriel à grande échelle. Le scale up s’effectue en plusieurs étapes : de la fiole d’Erlenmeyer au bioréacteur de paillasse, du bioréac- teur de paillasse au bioréacteur pilote de laboratoire et du bioréacteur pilote de laboratoire au bioréacteur industriel. Il est impossible de conserver l’ensemble des paramètres identiques ou proportionnels au changement d’échelle. Chaque transfert à une plus grande échelle est complexe car divers paramètres tels que le barème de stérilisation, l’aération et l’agi- tation sont modifiés lorsqu’on augmente le volume, le diamètre et la hauteur du bioréacteur. Des condi- tions physicochimiques similaires doivent être main- tenues dans l’environnement de chaque cellule mal- gré l’augmentation du volume de culture. À chaque étape du scale up, divers paramètres sont analysés puis modifiés car les réactions physicochimiques et enzy- matiques se produisant à l’intérieur du bioréacteur varient en fonction du volume du réacteur utilisé. En outre, lors du changement d’échelle il est indis- pensable : - - de prendre en compte les coûts d’investissement du matériel (bioréacteur, techniques d’extraction et de purification) et de fonctionnement (milieu de culture et énergie) ; - - de réaliser si possible une automatisation du maté- riel ; - - de réduire la production de déchets ; - - d’obtenir des produits correspondant à la qualité souhaitée. 1.3. Différents procédés de fer- mentation On distingue trois types de procédés de fermenta- tion (figure 3 ) : - - le procédé batch ou fermentation discontinue ; - - le procédé fed-batch ou fermentation discontinue alimentée ; - - le procédé de culture continue. 1.3.1. Procédé discontinu (batch) 1.3.1.1. Principe Le procédé est réalisé dans un système clos dans lequel un même volume de milieu non renouvelé est utilisé pour la croissance des micro-organismes ; la quantité de nutriments est donc limitée. 1.3.1.2. Courbe de croissance La courbe de croissance microbienne en mode dis- continu fait apparaître différentes phases (figure 4 ). Les phases de latence et d’accélération corres- pondent à une période d’adaptation métabolique du micro-organisme au milieu. La phase de latence sera réduite au maximum en fermentation industrielle. La phase exponentielle de croissance est la phase au cours de laquelle la vitesse spécifique de croissance Q x expo est maximum. La quantité de nutriments est en excès et la biomasse augmente donc le plus rapi- dement. Les produits formés au cours de cette phase sont les métabolites primaires. Tant que n’apparaît pas de facteur limitant la croissance, la phase expo- nentielle se poursuit. En coordonnées semi-logarith- miques ln X = f (t), la courbe de la phase exponen- tielle est une uploads/Industriel/ 29416.pdf