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Chapitre III Diagnostic et évaluation 30 4. établissement des procédures de vér

Chapitre III Diagnostic et évaluation 30 4. établissement des procédures de vérification : La vérification de la méthode HACCP est une activité mise en œuvre pour s’assurer que ce système fonctionne efficacement. 4.1. Les analyses microbiologiques : Les produits alimentaires peuvent contenir une flore microbienne plus au moins abondante qui peut être nuisible pour leur qualité, et pour la santé du consommateur. Des micro-organismes sont utilisés comme des agents technologiques et leur présence est parfois indispensable pour certaines industries alimentaires. L’analyse bactériologique des produits alimentaires est indispensable pour :  Assurer au produit une bonne qualité et une longue conservation.  Garantir la qualité hygiénique du produit. 4.1.1. La matière première : a) L’eau de reconstitution : 1) Technique de prélèvement et d’échantillonnage : Le prélèvement s’effectue directement par le robinet de tank de lancement, ceci après avoir flambé l’orifice du robinet probablement désinfecté, on laisse couler un moment et à l’aide d’un flacon stérile, on prélève 250 ml. 2) Dilution : On travail avec la solution mère qui représente le prélèvement de 250 ml de l’eau de reconstitution. 3) Recherche microbiologique : L’eau constitue un élément essentiel dans l’industrie laitière les micro-organismes rencontré dans l’eau sont très variés, leur nature dépend de celle de l’eau à analysée. Les germes recherchés dans l’eau de reconstitution sont :  Recherche et dénombrement des Germes Totaux.  Recherche et dénombrement des germes de contamination fécale (Coliforme Totaux et Fécaux) Chapitre III Diagnostic et évaluation 31  Recherche et dénombrement des Entérocoques (Streptocoques Fécaux).  Recherche et dénombrement des Clostridies Sulfito-Reducteurs. 3.1) Recherche et dénombrement des Germes Totaux : schéma n° 01 Leur dénombrement nous renseigne sur la charge microbienne du produit, et il chiffre le degré de contamination. La technique utilisée est celle de numération en milieu solide (P.C.A ou T.G.E.A ) en boites de petries avec ensemencement dans la masse. Méthodologie : La technique consiste à introduire aseptiquement 1 ml de la solution mère dans chaque boites de petries (02 boites), couler par la suite environ 20 ml de la gélose P.C.A. Faire des mouvements circulaires pour bien mélanger et laisser les boites solidifier sur la paillasse. Incubation : - La 1ère boite sera incubée à 37°C pendant 24 heures. - La 2eme boite sera incubée à 22°C pendant 72 heures. Lecture : Les colonies de germes totaux se présentent sous forme lenticulaire en masse. Dénombrement : Il s’agit de compter toutes les colonies ayant poussé sur les boites en tenant compte du facteur suivant : - Ne dénombrer que les boites contenant entre 30 et 300 colonies. Chapitre III Diagnostic et évaluation 32 1 ml 1 ml - Ajouter 20 ml de gélose PCA ou TGEA - Laisser solidifier sur paillasse - Incuber pendant : 22°C (72 heures) 37°C (24 heures) - Dénombrer les colonies lenticulaires en masse. Eau à analysée Schéma n° 01 : recherche des Germes Totaux dans l’eau. Chapitre III Diagnostic et évaluation 33 3.2) Recherche et dénombrement des contaminations fécales (Coliformes Totaux et Fécaux) : schéma n° 02 La méthode adapter pour cette analyse est la technique du dénombrement en tube multiple (NPP). (Annexe Le milieu utilise est le BCPL (Bouillon Lactose au Pourpre Bromocréol). La technique en milieu liquide fait appel à deux tests consécutifs à savoir :  Le test de présomption : réservé à la recherche des Coliformes.  Le test de confirmation : (test Mac Kenzie) réservé à la recherche des Coliformes Fécaux (à partir des tubes positifs du test de présomption). Test de présomption : Porter aseptiquement de l’échantillon d’eau à analysée : - 50 ml dans un flacon contenant 50 ml du milieu BCPL (D/C) muni d’une cloche de durham. - 5 fois 10 ml dans 05 tubes contenant 10 ml de milieu BCPL (D/C) muni d’une cloche de durham. - 5 fois 1 ml dans 05 tubes contenant 10 ml de milieu BCPL (S/C) muni d’une cloche de durham. Incubation : L’incubation se fait à 37°C pendant 24 heures. Lecture : Les tubes et flacon positifs présentent à la fois :  Un dégagement gazeux (supérieur au 1/10 de la hauteur de la cloche.  Un trouble microbien accompagné d’un virage de couleur du milieu au jaune (ce qui constitue le témoin de la fermentation du lactose présent dans le milieu).  Les résultats sont négatifs si les tubes et flacon ne présentent aucun trouble et aucun dégagement gazeux.  La lecture se fait selon la prescription de la table de Mac Grady (Annexe Chapitre III Diagnostic et évaluation 34 Test de confirmation au test de Mac Kenzie : Les tubes de BCPL trouvés positifs lors du dénombrement des Coliformes Totaux, ferrant l’objet d’un repiquage dans le milieu de BCPL muni d’une cloche de durham et EPEI (Eau Peptone exemple d’Indol). Incubation : L’incubation se fait à 44°C pendant 24 heures. Lecture : Les tubes et flacon positifs présentent à la fois :  Un dégagement gazeux (supérieur au 1/10 de la hauteur de la cloche).  Un anneau rouge en surface témoin de la production d’indol par l’Echérichiacoli après adjonction de 02 à 03 gouttes de réactif de Kowacs. La lecture finale se fait selon la prescription de la table de (NPP) en tenant compte du fait qu’Echérichiacoli est à la fois producteur de gaz et d’indol à 44°C. Chapitre III Diagnostic et évaluation 35 250ml Eau a analysée Test de présomption 10 ml 1 ml BCPL (D/C) + Cloche durham BCPL (D/C) BCPL (S/C) Incubation à 37°C pendant 24 H Réaction négative BCPL EPEI 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 50 ml 1O ml Trouble microbien + Gaz dans la cloche Réaction positive Test de confirmation Anneau rouge Incubation à 44°C pendant 24 H +2 gouttes du kowacs Schéma n°02 : Recherche des Coliformes (Totaux et Fécaux) dans l’eau. Chapitre III Diagnostic et évaluation 36 3.3) Recherche et dénombrement des Clostridium Sulfito-Réducteurs : schéma n°03 Les Clostridium sulfito-Réducteurs sont des germes anaérobies qui ont le pouvoir de réduire le sulfite en sulfure, et capables de former des spores dans les conditions défavorables. Méthodologie : Prendre 05 tubes vides et stériles, mettre 5ml d’eau à analysée dans chacun des 04 tubes et 1ml d’eau à analysée dans le 5ème tube. Puis, porter les tubes au bain marie à 80°C pendant 10mn, et après refroidir immédiatement ces tubes sous jet d’eau froide. Ensuite, ajouter environ 20ml de gélose VF (viande foie) (après avoir ajouté à cette dernière une ampoule de 5ml de sulfite de sodium et une ampoule de 1ml de l’alun de fer) dans chaque tubes. Incubation : Incuber les 05 tubes à 46°C pendant 48 heures. Lecture : La 1ere lecture se fait impérativement après 16 heures d’incubation. Dans le cas où il n’y pas de colonies noires, réincuber les tubes et effectuer une 2ème lecture après 24 heures voir 48 heures. Dénombrement : On compte les colonies noires directement dans les tubes positifs. On note : - Le nombre de Clostridiums Sulfito-Réducteurs dans 20 ml. (Somme des résultats des 04 tubes) - Le nombre de Clostridiums Sulfito-Réducteurs dans 1 ml. Chapitre III Diagnostic et évaluation 37 5 ml 5 ml 5 ml 5ml 1ml Eau à analysée Ajouter environ 20 ml de gélose VF (+02 ampoules contenant : 5 ml de sulfite de sodium, 1 ml de l’alun de fer) Puis incuber à 46°C pendant 16-24 ou au plus tard 48heures. La lecture se fera sur 1 ml La lecture se fera sur 20 ml la somme des 04 tubes Chauffage à 80°C, 10 minutes Refroidissement brutal sous l’eau de robinet Schéma n° 03 : Recherche des Clostridiums Sulfito-Réducteurs dans l’eau de reconstitution Chapitre III Diagnostic et évaluation 38 b) La poudre de lait écrémé et entier : 1) Technique de prélèvement et d’échantillonnage : Le lieu de prélèvement est le laboratoire des analyses microbiologiques, 03 échantillons sont prélevés à partir de 03 sacs de 25kg de poudre de lait à 0%, et à 26% de matière grasse, cette poudre est conditionnée dans des sacs en polyéthylènes et doublés en papier hermétiquement fermé. La surface des sacs a été nettoyée et désinfectée par l’alcool et la couche supérieure a été écartée à l’aide d’une spatule stérile. On procède à un échantillonnage à l’aide d’une sonde métallique stérile à proximité de la flamme. 2) Dilutions : Introduire aseptiquement 25 g de poudre dans un flacon stérile contenant 225ml de TSE puis homogénéisé l’ensemble a fin d’obtenir la solution mère. A partir de cette dernière, on prélève 1ml à l’aide d’une pipette stérile et on le porte dans un tube contenant 9ml d’eau physiologique, c’est la dilution 10-1. On prend 1ml de la dilution 10-1 à l’aide d’une autre pipette et on le porte dans un autre tube contenant 9 ml d’eau physiologique ce qui nous donne la dilution 10-2. La même technique est répète pour obtenir la dilution 10-3. 3) Recherche microbiologique : Les germes recherchés dans la poudre de lait sont : uploads/Industriel/ 13-analyses-microbiologiques.pdf