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Module : Techniques d’analyses microbiologiques Préparé par Dr. NAS Fatima Ep.

Module : Techniques d’analyses microbiologiques Préparé par Dr. NAS Fatima Ep. RABEHI Cour 5. Techniques récentes de numération (techniques rapides) 5. 1. spectroscopiques 5. 2. électrochimiques 5. 3. autres procédés 5. Techniques récentes de numération Introduction • Les méthodes classiques de culture et de dénombrement sont peu coûteux, mais nécessite la croissance des microorganismes afin qu’ils soient détectés par l’œil humain. • Les délais d’obtention des résultats sont longs : minimum 5 jours pour un test de dénombrement de germes. Durant cette attente de résultats, la production peut être arrêtée ou, face aux besoins de productivité de l’industrie, des lots sont engagés à risque. C’est-à- dire que des lots potentiellement contaminés continuent leur processus de fabrication. • Aujourd’hui de nouvelles méthodes microbiologiques rapides sont disponibles et permettent de répondre au besoin de réactivité des entreprises. 5. Techniques récentes de numération 5. 1. Techniques spectroscopiques Le principe repose sur la réponse d’un colorant redox à la présence de microorganismes métaboliquement actifs qui se traduit par un changement de couleur. Deux colorants sont couramment utilisés pour estimer le nombre de microorganismes viables : le bleu de méthylène (passe du bleu au blanc) et la résazurine, qui a été utilisée dans des contrôles des laits et les viandes fraiches et hachées. Ce colorant est réduit et passe du bleu au rose à l'incolore. Le temps nécessaire à la décoloration peut être mesuré pour évaluer le nombre de microorganismes viables. L’appréciation de la décoloration s’effectue généralement à l’ œil ou à l’aide d’un spectrophotomètre. a. Réduction des colorants 5. Techniques récentes de numération • La technique des colorants redox repose sur l’évaluation de l’activité de la réductase, cependant de nombreux autres enzymes ont été utilisés pour détecter et évaluer la présence des microorganismes, c’était le cas des : phosphatases, estérases (pour évaluer le nombre des bactéries viables dans le lait, viandes et le poissons), et la glutamate décarboxylase (pour évaluer le nombre d’E. coli dans le lait). b. Mesure d’activités enzymatiques 5. Techniques récentes de numération • L’Adénosine Triphosphate (ATP) est un marqueur de viabilité cellulaire, l’ensemble des cellules vivantes stocke de l’énergie sous forme d’ATP. La présence d’ATP dans un échantillon revient à détecter des microorganismes vivants. • La technique de l’ATP-métrie consiste à doser l’ATP utilisant le complexe ATP- luciférine-luciférase. • Certains microorganismes peuvent émettre de la lumière suite à l'activité de la luciférase sur la luciférine. La réaction nécessite la présence de Mg2+ et de l'ATP qui facilite la formation du complexe ATP-luciférine-luciférase, c. ATP-métrie (réaction de bioluminescence) 5. Techniques récentes de numération • Cette technique est utilisée pour surveiller l'hygiène dans les industries. • La quantité de lumière émise étant proportionnelle à la quantité d’ATP. Il suffit donc de mesurer la quantité de lumière émise, à l’aide d’un luminométre, en Unité Relative de Lumière (URL), pour déterminer la quantité d’ATP initialement présente et donc le nombre de micro-organismes présent dans l’échantillon • En présence d’oxygène, ce complexe est oxydé donnant l'oxyluciférine dans un état excité, ensuite retourne à l'état stable et libère un photon de lumière. La réaction de bioluminescence 5. Techniques récentes de numération d. Marqueurs radiométriques Cette technique est basée sur l'incorporation des 14C marqué dans un milieu de croissance de sorte que, lorsque les microorganismes utilisent ce métabolite, le 14CO2 est libéré et ainsi il mesuré par utilisation d'un compteur de radioactivité ou par un spectrophotomètre. Le 14C est incorporé en 14C-glucose pour les microorganismes qu’ils utilisent habituellement, sinon il est incorporé en 114Cformate ou 14C-glutamate pour les autres. La technique consiste à réaliser une culture en milieu contenant la molécule marquée et après l'incubation la culture est testée périodiquement pour déterminer la présence de 14CO2. Le temps nécessaire pour détecter le 14CO2 est inversement proportionnel au nombre de microorganismes présents. 5. Techniques récentes de numération 5. 2. Techniques électrochimiques Impédancemétrie • Cette technique est fondée sur la mesure des variations d’ impédance électrique (ou de conductance) dans un milieu de culture pourvu de microorganismes par rapport au même milieu dépourvu de microorganismes. • L’activité métabolique et la croissance des microorganismes dans un milieu de culture entraînent la production de métabolites fortement chargés (acides aminés, acides organiques…) à partir de composés organiques faiblement chargés (protéines, polyosides…). • Ces modifications électriques vont être mesurées, à partir de récipients contenant l’échantillon à analyser et qui sont reliés à des électrodes. Il existe une relation linéaire décroissante entre le temps de détection du changement de conductance et le nombre initial de microorganismes. • Plusieurs types d’appareils sont actuellement commercialisés : le Bactometer® (appareil qui assure automatiquement l'incubation et la lecture simultanément), et le Malthus® 5. Techniques récentes de numération 5. 3. Autres procédés • Cette technique repose sur la mesure des faibles variations de chaleur (mesure de l'enthalpie impliquée dans la dégradation de substrats de croissance). • La production de chaleur mesurée, au moyen de microcalorimètres, est étroitement liée aux activités cataboliques des microorganismes. Microcalorimétrie uploads/Industriel/ cours-5.pdf