Remerciez-le!

Remerciez @Admin pour avoir partagé cet document gratuitement, de la manière la plus simple, en partageant sur les réseaux sociaux.

3 Chapitre Les objectifs du programme Pour approfondir les méthodes de dénombre

3 Chapitre Les objectifs du programme Pour approfondir les méthodes de dénombrement vues en classe de première, l’étude visera les caractéristiques essentielles des différentes méthodes de dénombrement et les paramètres qui les différencient. ACTIVITÉS COURS 1. Dénombrement après filtration sur membrane 56 2. Dénombrement en milieu liquide 58 3. Dénombrement en milieu solide (masse, surface) 60 4. Dénombrement par observation directe 65 N°1 Diagnostic d’une infection urinaire 68 N°2 Dénombrement des E. coli dans une préparation à base de viande 71 N°3 Dénombrement des entérocoques dans une eau 73 N°1 La filtration d’un liquide 76 FICHE TECHNIQUE Dénombrement d’une flore d’un produit microbien 56 Dans certains produits liquides (eau, solutés pharmaceu tiques buvables ou injectables...), les micro-organismes sont à une concentration très faible (voire nulle si le pro duit est stérile). Leur dénombrement (rendu en UFC par unité de volume) impose donc de « concentrer les micro-organismes » pour pouvoir compter des colonies. Cette « concentration » se fait grâce à la filtration d’un grand volume de produit sur une membrane retenant les micro-organismes. 1.1. Matériel nécessaire Les différentes étapes d’un dénombrement par une tech nique de filtration nécessitent l’utilisation d’un matériel spécifique. 1.1.1. Une membrane filtrante La membrane filtrante (document 1 ) a des pores d’un diamètre de 0,45�µ�� µm�� dont la disposition selon un ré seau en trois dimensions permet de retenir à sa surface les bactéries. En effet le diamètre des pores du filtre est inférieur à celui des bactéries classiquement rencontrées. Il existe aussi des membranes de porosité de 0,22 µm pour retenir les bactéries les plus petites, des bacilles très fins qui pourraient se faufiler dans le maillage de la membrane de 0,45 µm (cas de Pseudomonas aeruginosa) ou encore des spores. Dénombrement d'une flore d'un produit microbien Le terme « dénombrement d’une flore » signifie que l’analyse microbiologique doit permettre de quanti fier dans l’échantillon une flore particulière. Le résultat d’une telle analyse quantitative est rendu sous forme d’une concentration en micro-organismes (appartenant à une flore particulière) par unité de masse ou de volume d’échantillon. Les échantillons peuvent correspondre : - - à des bioproduits, à de l’eau, pour un dénombrement de : · · flore test d’hygiène générale (Flore Mésophile Aéro bie Totale), · · flore témoin de contamination fécale (coliformes totaux, coliformes thermotolérants, E. coli, Entéro coques, spores de bactéries anaérobies sulfito-réduc trices,…), · · flore pathogène (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Legionella pneumophilia, Listeria monocytogenes…) ; - - à des prélèvements issus de l’environnement (air, sol) pour un dénombrement des micro-organismes sapro phytes (bactéries, levures, moisissures) ; - - à des ferments contenant des micro-organismes utiles, permettant la transformation d’une matière première en produit alimentaire fini : · · Saccharomyces cerevisiae (levure de bière) et fabrication de la bière à partir d’un moût obtenu principalement à partir d’orge germé, · · Streptococcus salivarus subsp. thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus et fabrication du yaourt à partir du lait. Il existe de nombreuses méthodes de dénombrement. Les méthodes directes Certaines nécessitent une culture réalisée dans des conditions d’incubation adaptées aux exigences de la flore dénombrée (temps, température, atmosphère) et à l’aide d’�� un milieu adapté �� à ses �� exigences nutritives (mi lieu pouvant en plus être sélectif et discriminatif). La culture peut se faire sur différents types de milieux : - - sur milieu solide (milieu gélosé) : · · dénombrement dans la masse (avec ou sans double couche), · · dénombrement en surface (boîte de Petri classique ou boîte contact). Cette technique a été automatisée par la société Intersciences qui a développé un ensemen ceur en surface Spiral® (cf. p. 64), · · dénombrement après culture sur un filtre ayant permis une concentration des micro-organismes (échantillons peu concentrés en micro-organismes) puis déposé sur un milieu gélosé. Il existe des supports alternatifs aux supports tradi tionnels comme le PetrifilmTM ou les lames gélosées ; - - en milieu liquide (notamment méthode du Nombre le Plus Probable-NPP). La méthode traditionnelle avec culture en tubes à essais peut être miniaturisée (culture en microplaques, cf. p. 63). D’autres méthodes directes ne nécessitent pas de mise en culture : - - estimation de la biomasse ou du nombre de cellules par unité de volume par mesure du trouble d’une culture (ou d’une suspension) en milieu liquide (opacimétrie, turbidimétrie) (cf. p. 57) ; - - cytométrie : · · manuelle : dénombrement en hématimètre, associé ou non à une estimation de la viabilité des micro- organismes, · · automatisée : cytométrie de flux (cf. p. 67). Les méthodes indirectes Elles associent le résultat de la mesure d’une acti vité biochimique à un nombre de micro-organismes : dénombrement par ATP-métrie (cf. p. 57). Chapitre 3 1. DÉNOMBREMENT APRÈS FILTRATION SUR MEMBRANE 57 Mesure du trouble et estimation de la biomasse ou du nombre de cellules par unité de volume Le trouble d’une suspension microbienne (bactéries, levures) est proportionnel à la biomasse présente dans la suspension. Cette technique ne distingue pas la biomasse morte de la vivante, mais son intérêt principal est sa rapidité et sa facilité d’application. La mesure peut se faire à l’aide d’un spectrophoto mètre en assimilant l’absorbance mesurée entre 600 et 650 nm à celle du trouble. Ce principe est également celui de la méthode des étalons de MacFarland (solutions troubles obtenues traditionnellement par précipitation de sulfate de baryum). On peut comparer visuellement le trouble d’une suspension microbienne à celui d’un étalon artificiel pour en estimer sa concentration. En effet, le trouble développé par chaque étalon est assimilable à une concentration bactérienne selon le tableau de correspondance suivant : Étalon McFarland Numéro 0,5 1 2 3 4 Chlorure de Baryum à 1 % (mL) 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 Acide sulfurique à 1 % (mL) 9,95 9,9 9,8 9,7 9,6 Concentration cellulaire approximative (x108 UFC.ml-1) 1,5 3,0 6,0 9,0 12,0 Absorbance à 600 nm 0,132 0,257 0,451 0,582 0,669 L’ATPmétrie L’ATPmétrie est une technique de dosage instantané de l’ATP (Adénosine triphosphate), molécule de stockage d’énergie présente dans les organismes vivants. La technique, basée sur le principe de bioluminescence, est une réaction enzymatique traduisant une quantité d’ATP dans un échantillon en une quantité de lumière émise et mesurée par un luminomètre (valeur obtenue en Unité Relative de Lumière (URL) : ATP + luciférine + O2 luciférase Mg 2+ AMP + PPi + oxyluciférine + lumière On distingue trois sources d’ATP au niveau des prélèvements à analyser : - - ATP d’origine microbienne, provenant des bactéries, des levures ou des moisissures ; - - ATP dit « somatique », provenant de cellules d’êtres vivants (lait, sang, muscle, végétaux,…) ; - - ATP extracellulaire, provenant de débris de micro-organismes ou de cellules somatiques. Cet ATP est rapidement dégradé dans le milieu extérieur. Le problème des opérations de nettoyage et de désinfection dans les bio-industries est celui de l’hy giène. Le nettoyage et la désinfection sont donc des étapes primordiales de la fabrication. Appliqué ainsi au nettoyage-désinfection, le dosage de l’ATP sur les surfaces ou les eaux de rinçage permet la détection de résidus organiques vivants (résidus alimentaires) et de développement microbien : - - si de l’ATP est détecté sur une surface ou dans un liquide, c’est qu’il y a présence de cellules vivantes ; - - dans le cas d’ATP microbien, la présence de micro-organismes représente un risque direct puisqu’il peut y avoir contamination des produits ; - - en revanche, si l’ATP est d’origine somatique, c’est qu’il reste des débris organiques sur la surface ; ceux-ci peuvent servir de support de croissance pour des micro-organismes, ce qui constitue un risque indirect pour les produits. 1 Membrane filtrante et aspect microscopique du réseau tridimensionnel d’une membrane de cellulose 58 2.1. Principe Si les conditions optimales de croissance sont réunies, un seul micro-organisme présent dans l’inoculum intro duit dans un milieu liquide se développe en y créant un trouble (et une modification visible du milieu si celui- ci est discriminatif). La lecture des tubes contenant le milieu liquide et ensemencés avec l’inoculum est donc de type binaire : - - résultat négatif si absence de trouble et de modi fication du milieu : il y avait moins de un micro- organisme présent dans l’inoculum introduit dans le milieu liquide ; - - résultat positif si présence de trouble (et de modifica tion du milieu si celui-ci est discriminant) : il y avait au moins un micro-organisme présent dans l’inoculum introduit dans le milieu liquide. Le résultat sera positif, que l’inoculum introduit dans le tube de milieu liquide contienne 1, 10, 100, 1 000… micro-organismes. La méthode repose sur la répartition aléatoire des micro- organismes dans le prélèvement (méthode statistique reposant sur l’utilisation de la loi de Poisson). On ense mence donc une série de tubes avec un volume donné du produit à analyser ou ses dilutions, à raison de 1, 2, 3, 5 voire même 10 tubes par dilution testée. Connaissant le nombre de résultats positifs obtenus dans la série de tubes, on peut déterminer la concentration en micro-organismes présents dans une unité de volume uploads/Geographie/ t1c3.pdf