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1ère séance de TP (DCEM1) Section de Microbiologie Département des Sciences de

1ère séance de TP (DCEM1) Section de Microbiologie Département des Sciences de Base B Faculté de Médecine de Tunis Classification bactérienne Etapes du diagnostic bactériologique PROGRAMME DE LA 1ère SEANCE 9h00 – 9h 30 : Présentation du topo à la salle de Staff 9h30 – 9h45 : Présentation des différents milieux de culture (liquides et solides) utilisés en bactériologie 9h45 – 10h00 : Préparation de l’étalement pour la coloration de Gram Ensemencement d’un germe pur sur gélose ordinaire 10h00 – 10h30: Réalisation de la coloration de Gram & Lecture au microscope optique (objectif 100) LES MILIEUX DE CULTURE Un milieu de culture est une préparation, liquide ou gélosée, au sein de laquelle des micro- organismes peuvent se multiplier. Il doit donc satisfaire les exigences nutritives du micro- organisme étudié. D’une manière générale, on distingue : 1. Les milieux ordinaires permettant la multiplication des germes peu exigeants et à multiplication rapide. - Gélose nutritive ordinaire & Bouillon ordinaire - Gélose Mueller Hinton (MH) utilisée pour l’étude de la sensibilité d’une bactérie aux antibiotiques. 2. Les milieux enrichis : Ils sont obtenus en incorporant à un milieu de base adéquat des liquides ou suspensions riches en molécules organiques diverses. a. Gélose au sang frais (GS): L’addition de sang frais au milieu de base permet d’apporter des facteurs de croissance nécessaires à la croissance des streptocoques. Il permet la lecture d’un caractère important: le type d’hémolyse. Ainsi, les colonies peuvent être β hémolytiques: entourées d’une zone claire d’hémolyse signant l’hémolyse totale des GR contenus dans la gélose; α hémolytiques entourées d’une zone floue et verdâtre témoignant de l’hémolyse partielle des GR contenus dans la gélose ou non hémolytiques. b. Gélose au sang cuit (GC) : milieu enrichi préconisé pour l’étude des Neisseria et Haemophilus influenzae). 3. Les milieux sélectifs pour une espèce bactérienne sont des milieux satisfaisant les exigences nutritives et les conditions de développement particulières à cette espèce. i. Gélose Chapman : Ce milieu contient un inhibiteur correspondant à de fortes concentrations en chlorure de sodium (75 g/l), ce qui permet un isolement sélectif de Staphylococcus tolérant les fortes concentrations en NaCl ; On peut étudier la fermentation du mannitol par virage au jaune de l’indicateur coloré, le rouge de phénol, autour des colonies. ii. Gélose Salmonella-Shigella (SS): Milieu sélectif permettant l’isolement des Salmonella et Shigella. Les inhibiteurs contenus dans ce milieu empêchent la pousse de toutes bactéries Gram+, et rendent difficile la croissance des bactéries Gram- autres que Salmonella et Shigella. Le milieu contient du lactose pouvant être fermenté et contient du thiosulfate pouvant donner du H2S. Trois types de colonies peuvent être observés : Colonies rouges : lactose + Colonies incolores : lactose - Colonies à centre noir : H2S + iii. Gélose Désoxycholate Lactose (GDL) : gélose contenant du lactose et 2 inhibiteurs des bactéries Gram+. Elle permet de rechercher le caractère « utilisation du lactose ». Les bactéries fermentant le lactose formeront des colonies rouges et celles ne fermentant pas le lactose donneront des colonies incolores. iv. Gélose au sang négram (GSN) : gélose au sang additionné de négram (antibiotique actif sur les BGN) : gélose sélective sur laquelle ne pousseront que les GP. ENSEMENCEMENT SUR GELOSE L’ensemencement consiste à déposer dans un milieu stérile des germes prélevés à partir d’un milieu de culture mère (bouillon de culture). Le transport est effectué avec une anse de platine (Figure 1). Figure 1 : Anse de platine - Réalisation de l’ensemencement par la technique des stries (Epuisement de 3 quadrants): - La manipulation doit se faire dans la zone stérile autour du bec Bunsen (Figure 2) 1. Prendre dans la main gauche, le tube de culture microbienne en bouillon, agiter la culture par rotation entre les paumes de la main. 2. De la main droite, saisir l’anse, la tenir verticalement dans la flamme et la chauffer au rouge. Flamber aussi l'extrémité du manche portant le fil, laisser refroidir une vingtaine de secondes en la gardant toujours dans la main droite. 3. Enlever le bouchon avec l'auriculaire et la paume de la main droite et flamber l'orifice du tube aussi verticalement que possible (pour éviter l'entrée de l'air). Plonger le fil bouclé dans la culture puis replacer le bouchon après avoir flambé de nouveau l'ouverture du tube. Déposer le bouillon dans le portoir. 4. Diviser mentalement la boîte en 3 secteurs égaux. Tenir la boîte de la main gauche et déposer l'échantillon en laissant traîner l'extrémité de l'anse en zig zag dans le premier secteur de la périphérie vers le centre de la boîte. Repasser l'anse à la flamme, la laisser refroidir, faire tourner la boîte d'un secteur et repasser avec l'anse dans la partie supérieure du dépôt initial qu'on étalera dans le deuxième secteur comme précédemment sans croiser de nouveau le premier dépôt. Procéder de la même façon pour le 3ème secteur de la boîte (Figure 3). Placer la boîte à l'étuve (25 à 30°C), posée à l'envers c'est à dire sur le couvercle. Figure 2 : Zone de stérilité Figure 3 : Méthode d’ensemencement en strie COLORATION DE GRAM Principe : C’est une coloration différentielle tenant compte des différences structurales de la paroi bactérienne. Réalisation : 1- Etalement et fixation du frottis : fixation simple à l’eau et à la flamme selon les indications suivantes : - Sur une lame, déposer une goutte de la suspension bactérienne - Étaler la goutte, laisser sécher et fixer à la flamme du bec Bunsen (3 passages successifs) - Poser la lame sur le portoir reposant sur un bac de coloration 2- Réalisation de la coloration a) Déposer du violet de gentiane ou cristal violet. Laisser agir de 30 secondes à 1 minute puis rincer à l'eau. b) Verser du lugol (solution d'iode iodo-iodurée): et laisser agir 20 secondes ; Rincer à l'eau. c) Décolorer à l'alcool : verser goutte à goutte l'alcool sur la lame inclinée obliquement, et surveiller la décoloration (5 à 10 secondes). Le filet doit être clair à la fin de la décoloration. Rincer sous un filet d'eau d) Recolorer à la fuchsine et laisser agir 30 secondes à 1 minute. Laver doucement à l'eau. e) Sécher la lame avec du papier absorbant f) Déposer une goutte d'huile à immersion sur la lame g) Observer au microscope avec objectif 100 (grossissement ×1000). 3- Explications des différentes étapes : - Les étapes « a et b » colorent en violet le contenu de la bactérie. Le violet de gentiane se fixe sur les composants cytoplasmiques de toutes les bactéries. Le lugol permet de fixer cette coloration interne. - L'étape « c » (alcool) sert à décolorer le cytoplasme des bactéries qui seront dites à « Gram négatif ». En effet, celles-ci ont une paroi pauvre en peptidoglycane, donc plus fine, qui va laisser passer l'alcool (molécule lipophile), et qui décolorera le cytoplasme en éliminant le violet de gentiane. Au contraire, pour les bactéries dites à « Gram positif » la paroi constitue une barrière imperméable à l'alcool car elle est composée d'une « couche » de peptidoglycane plus importante donc de ce fait ; plus épaisse. Elles resteront alors violettes. - L'étape « d » est une contre-coloration ayant pour but de donner aux bactéries à Gram négatif précédemment décolorées, une teinte rose permettant de les visualiser au microscope. Les bactéries à Gram positif restées violettes seront évidemment insensibles à cette contre-coloration plus pâle que le violet imprégnant leur cytoplasme. La coloration de Gram permet de différencier la paroi bactérienne et de scinder les bactéries en deux grands groupes: o Gram+ qui ont un peptidoglycane épais (ex : Staphylococcus, Streptococcus) o Gram- qui ont un peptidoglycane fin, surmonté d’une membrane externe lipidique (ex : Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa). PARTIE POUR L’ENSEIGNANT : Samedi : Préparer pour démonstration les milieux de culture suivants: - GO – MH – GS- GSN- GC- SS- GDL- G. Chapman (une boîte stérile de chaque) - 1 BO et 1 tube de Reilly (stériles) Ensemencer pour démonstration: - 3 GS : bactéries non hémolytiques, β-hémolytiques et -hémolytiques - 2 G Chapman : S aureus et Staphylococcus mannitol – - SS : colonies H2S+, lactose- - 2 GDL : colonies lactose + et colonies lactose – - 1 BO et 1 tube de Reilly Lundi : Ensemencer des BO avec un germe pur (S aureus et E coli) (pour l’ensemencement des GO par les étudiants et pour la réalisation de la coloration de Gram) uploads/Geographie/ poly-tp-s1.pdf