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51 Continental J. Biological Sciences 3: 51 - 62, 2010 ISSN: 2141 - 4122 © Wilo

51 Continental J. Biological Sciences 3: 51 - 62, 2010 ISSN: 2141 - 4122 © Wilolud Journals, 2010 http://www.wiloludjournal.com EFFETS DU STRESS THERMIQUE SUR LA GERMINATION, LA DÉGRADATION DES RÉSERVES PROTÉIQUES ET MINÉRALES DES GRAINES DU GOMBO (Abelmoschus esculentus L.). Besma Ben Dkhil et Mounir Denden Adresse : Laboratoire d’Agronomie, Institut Supérieur Agronomique Chott-Marièm 4042, Sousse, Tunisie. E-mail : bbendkhil@yahoo.fr Résumé L’effet de la température sur la germination des graines du gombo (Abelmoschus esculentus L.) est étudié en relation avec la quantité d’eau absorbée, la mobilisation et la dégradation des réserves protéiques et l’utilisation des éléments potassium, sodium et calcium. Les résultats obtenus ont montré que le gombo est sensible à une variation de température, la germination est optimale à 25°C et elle est totalement inhibée à 10 et 40°C. Une basse température de 10°C a stimulé une augmentation de la teneur en protéines et de l’activité protéasique au niveau de l’embryon. L’inhibition de la germination à 40°C est la conséquence d’une inhibition de l’activité protéasique au niveau des cotylédons et d’une toxicité de l’embryon par l’élément sodium. Mots clés : germination, température, Abelmoschus esculentus, réserves protéiques, prtéases, réserves minérales. Abstract In order to study the physiological and biochemical responses of okra seed germination (Abelmoschus esculentus) during time under three temperature regimes (10, 25 and 40°C), an experiment was carried out on laboratory in a dark condition. Temperature effects on germination are studied in relation with water absorption, the degradation and mobilization of stored protein and mineral reserves. Results indicated that 25°C was the optimal temperature that favorises a good aptitude to germinate, whereas low (10°C) and high temperatures (40°C) inhibited germination. Low temperature (10°C) slowed the rate of imbibition, increased proteins content and protease activity. Thermoinhibition of germination at 40°C is the consequence of a decrease on protease activity and toxicity due to sodium accumulation. Key words: germination, temperature, Abelmoschus esculentus, stored protein, protease, minerals reserves. INTRODUCTION La germination est une phase physiologique pendant laquelle la graine passe de l’état de vie ralentie à l’état de vie active (Caboche et al., 1998). Elle est définie comme la somme des évènements qui conduisent la graine sèche à germer : cela commence par l’étape cruciale d’absorption de l’eau par la graine (Othman, 2005), se termine par l’allongement de l’axe embryonnaire et l’émergence de la radicule à travers les structures qui entourent l’embryon (Shereena et Nabeesa, 2006). La germination des graines nécessite la mobilisation des réserves accumulées au cours de la maturation dont leur dégradation apportera l’énergie nécessaire à la croissance de la plantule. Cette mobilisation est la résultante des activités hydrolytiques qui libèrent les nutriments à partir des tissus de réserve, d’une part, et des mécanismes de leur transport vers les tissus embryonnaires, d’autre part (Mihoub et al., 2005). Selon les espèces, ces réserves peuvent être majoritairement de nature glucidique, lipidique et/ou protéique (Khemiri et al., 2004). La respiration, l’hydrolyse des réserves et les activités enzymatiques demeurent sous la dépendance de la température. En effet, toute variation de la température d’incubation peut affecter en plus de l’activité de 52 Besma Ben Dkhil et Mounir Denden: Continental J. Biological Sciences 3: 51 - 62, 2010 certaines enzymes, certains processus indispensables pour le contrôle de la germination comme la perméabilité membranaire et l’extensibilité de la paroi (Bewley and Black, 1992; Gul and Waber, 1999). Hawker et Jenner (1993) suggèrent que les hautes températures inhibent la germination des graines en limitant la disponibilité d’énergie et des hydrolysats. Evènement conséquent d’un retard et d’une inhibition de la synthèse et/ou l’activité des enzymes hydrolytiques. De même, les basses températures entraînent une perturbation et un retard de coordination lors de la mobilisation des réserves (Nykiforuk et Johnson- Flanagan, 1994). Le gombo est une plante connue pour ses fruits utilisés comme légumes. En Tunisie, la superficie emblavée en gombo est de 188 ha, la zone de production se situe essentiellement dans les régions de Tunis, Bizerte, Béja et Gafsa, la production nationale a atteint 560 tonnes. Certes, il existe des obstacles qui entravent le développement du gombo et qui limitent son extension dans le centre du pays. En effet, la sensibilité de cette espèce durant le stade germination est largement évoquée, elle est généralement attribuée à une imperméabilité des téguments qui s’oppose à la pénétration de l’eau et aux échanges gazeux (Demir, 2001). En plus de ce facteur biotique, s’ajoutent les facteurs abiotiques comme la température et la salinité. Albregts et Howard (1973) ont suggéré la sensibilité du gombo à la salinité et son exigence en chaleur. Il est admis aussi qu’une exposition des graines du gombo à des températures inférieures ou supérieures à leur température optimale de germination peut entraîner l’entrée en dormance secondaire. Les agricultures pratiquent quotidiennement le semis direct des graines, une telle pratique peut aggraver la situation au point où il serait difficile de contrôler les conditions adéquates pour réussir la germination et la levée des plantules. L’objectif de notre travail est d’étudier les réponses physiologique et biochimique du stress thermique au cours de la germination des graines du gombo (variété Marsaouia). MATÉRIEL ET MÉTHODES Matériel végétal La variété du gombo (Abelmoschus esculentus) utilisée est "Marsaouia". Il s’agit d’une variété locale produite par des agriculteurs de la région de la basse vallée de Majerda (Nord du pays). Conditions de germination Les graines du gombo sont stérilisées par l’alcool éthylique (70°C) pendant une minute, puis trempées dans l’hypochlorite de sodium à 15% (v/v) pendant 20 minutes. La mise en germination des graines est réalisée sous hotte à flux laminaire afin de s’assurer des conditions aseptiques et d’éviter toutes contaminations. Après rinçage à l’eau distillée, les graines stérilisées sont ensemencées dans des boites de Pétri de 90 mm de diamètre tapissées de deux couches de papier filtre imbibées d’eau distillée stérile à raison de 25 graines par boite. La germination est effectuée à l’obscurité dans des germoirs à température réglable (25 et 40°C) et dans une enceinte réfrigérée (10°C). Les boites sont soigneusement fermées et entourées avec du parafilm pour éviter l’évaporation de la solution d’imbibition. Le critère de germination retenu correspondant à la sortie de la radicule hors des téguments de 2 mm. La germination est relevée tous les deux jours, afin de déterminer l’énergie germinative et le pouvoir germinatif. Test de réversibilité de germination Il s’agit de transférer les graines qui n’ont pas germé au bout de 24 heures aux températures 10 et 40°C à une température optimale de 25°C pendant 6 jours. Test de viabilité des graines Ce test concerne les graines qui n’ont pas germé à 10 et 40°C, elles sont décortiquées puis elles sont trempées dans une solution de triphényl-tétrazolium (0.1%) à l’obscurité. La viabilité des graines s’observe par la coloration en rouge des parties vivantes après une heure de trempage (Guy, 1993 ; 2000). 53 Besma Ben Dkhil et Mounir Denden: Continental J. Biological Sciences 3: 51 - 62, 2010 Détermination de la teneur en eau Le poids frais des graines mises en germination à 10, 25 et 40°C a été mesuré toutes les deux heures pendant 24 heures, le poids sec est déterminé après séchage des échantillons à 80°C pendant 48 heures. La teneur en eau des graines est déterminée par la différence entre la masse de matière fraîche et la masse de matière sèche rapportée à la matière sèche, elle est exprimée en ml H2O.g-1MS. Dosage des protéines solubles Le dosage des protéines en solution est déterminé par la méthode de Bradford (1976), la matière fraîche (100 mg) est homogénéisée dans une solution tampon phosphate 0.1 M (pH 7). L’homogénéisât est centrifugé à 13000 rpm pendant 45 min, à 1ml du surnageant on ajoute 5ml de réactif de Bradford et le mélange est incubé pendant 15min à l’obscurité. La variation d’absorbance est mesurée au spectrophotomètre à 595 nm et convertie en mg protéines/ g de matière fraîche. Une gamme étalon est établie à l’aide d’une solution de sérum albumine de bœuf (BSA). Détermination de l’activité protéasique La mesure de l’activité de l’enzyme protéase a concerné les cotylédons et l’embryon de la graine, elle est déterminée selon la méthode d’Anson (Yang and Huang, 1994). Pour cela, 100 mg du matériel végétal frais ont été broyés à froid dans une solution tampon de phosphate 0.1 M (pH 7). Le broyat est ensuite centrifugé à 13000 rpm pendant 45 min, le surnageant récupéré constitue l’extrait enzymatique qui est utilisé pour mesurer l’activité de l’enzyme protéase. Cette dernière est déterminée à partir de 1 ml d’extrait en présence de 1 ml d’une solution de caséine à 1%. Après 20 min d’incubation à 37°C, la réaction est arrêtée par addition de 3 ml d’une solution d’acide trichloroacétique à 10%. La tyrosine libérée est dosée à 280 nm au spectrophotomètre (Camspec M330 UV/Vis). L’activité spécifique est exprimée en A280/min/g de matière fraîche. Dosages des ions Na+, K+ et Ca++ Les graines sont séchées à l’étuve pendant 48 heures à 80°C, puis elles sont placées dans des piluliers contenant chacun 25 ml d’une solution d’acide nitrique (0.1 N). L’extraction des ions dure 48 heures à uploads/Geographie/ effets-du-stress-thermique-sur-la-germination-la-degradation-des-reserves-proteiques-et-minerales-des-graines-du-gombo-abelmoschus-esculentus-l.pdf