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54 I – CADRE D’ETUDE Ce Travail a été effectué à l’Unité de Recherche et de Bio

54 I – CADRE D’ETUDE Ce Travail a été effectué à l’Unité de Recherche et de Biotechnologie Microbienne du Laboratoire de Bactériologie-Virologie de l’Hôpital Aristide Le Dantec. II - SOUCHES BACTERIENNES Nous avons utilisé des souches de contrôle de staphylocoques, de streptocoques, d’entérobactéries ainsi que des isolats de contrôle de Mycoplasmes urogénitaux. III – MATERIEL III.1. – MATERIEL POUR LA PREPARATION DES MILIEUX - Agitateur magnétique - Balance de précision - pH-mètre - Seringues - Filtre de 0,2 µm de diamètre - Micropipettes de 100 et 200 µl - Embouts stériles ; - Flacons en verre avec bouchon à vis de 5, 100 et 150 ml - Tubes stériles à bouchon de 2,5 et 5 ml - Erlen-meyer - Bain-marie - Autoclave. 55 III.2. – MATERIEL POUR LE CONTROLE DE QUALITE III.2.1. - Matériel léger - Microplaques de 20 ou 96 puits avec couvercle - Micropipettes de 100 µl et 200 µl - 1 bécher rempli d’eau de javel - 1 plateau (inoxydable de préférence) - 1 papier buvard - 1 étalon de Mac Farland d’échelle 1(*) - Anse de platine - Emballage plastique - Lame porte-objets - Boîtes de Pétri - Générateur de CO2 ou bougie. III.2.2. - Matériel lourd - Bec bunsen - Etuve - Four à micro-ondes - Hygromètre - Appareil de scellage - Dessiccateur sous vide à air renouvelé - Microscope optique - Jarre d’incubation. ------------------------------------------------------------------------------------------- (*) : Etalon de Mac Farland varie : - pour les Streptocoques : l’étalon de Mac Farland est d’échelle 4 - pour les Entérobactéries : l’étalon de Mac Farland est d’échelle 0,5. 56 II1.3. – MATERIEL POUR LA CONSERVATION DES SOUCHES - Cryotubes à billes - Tubes à visse - Tube nunc - Ecouvillons - Portoirs. 57 IV – LES STAPHYLOCOQUES IV.1. – REACTIFS IV.1.1. – Réactifs pour enrichissement et isolement - BTS : Bouillon Trypticase Soja -Gélose MH : Müller – Hinton - Gélose trypticase - soja - Sang de cheval IV.1.2. – Réactifs pour l’identification IV.1.2.1. – Substrats pour identification - Glucides : Glucose, Mannitol, Xylose, Saccharose, Glycérol, Mannose, Lactose, Rafinose. - MEVAG STREPTO/STAPH - Milieu de FALKOW - Milieu urée - tryptophane - Milieu de Clark et Lubs (VP) - Milieu à l’ONPG - Milieu pour la recherche de la nitrate réductase. IV.1.2.2. – Réactifs de révélation - Potasse à 10 % - Créatinine à 1 % - Alpha-naphtol - Acide sulfanilique à 8 g/l - Acide naphtylamine à 5 g/l. 58 IV.1.3. – Réactif pour la conservation des souches - Bouillon cœur – cervelle + 10 % de glycérol - Lait écrémé + 10 % de glycérol - Gélose MH : Muller – Hinton - Billes en tube. IV.2. - METHODOLOGIE IV.2.1. – Préparation des différents milieux IV.2.1.1. – Milieux d’enrichissement et d’isolement ■ Bouillon Trypticase-Soja C’est le milieu de régénération des souches conservées à +4°C ou –70°C.. Formule Réactifs Quantité - Trypticase soja 15 g - Eau distillée 500 ml Autoclaver à 121°C pendant 15 mn. Répartir dans les tubes à visse. ■ Gélose au sang ordinaire : G.S.O. C’est le milieu d’isolement des Staphylocoques ; il permet d’obtenir des colonies de taille plus importante. ■ Milieu de base Réactifs Quantité - Gélose Agar 8,5g - Trypticase soja 15g - Eau distillée 500 ml Autoclaver le mélange à 121°C pendant 15 minutes. Laisser refroidir. 59 ■ Milieu complet Réactifs Quantité - Milieu de base 500 ml - Sang de cheval 12,5 ml Au milieu de base refroidi, on ajoute du sang de cheval. Le mélange est homogénéisé puis réparti dans des boîtes de pétri à raison de 4 ml pour les boîtes de 8 cm de diamètre et 8 ml pour les boîtes de 16 cm de diamètre. N.B. : Ce milieu est aussi utilisé pour l’isolement des streptocoques (page.). IV.2.1.2. – Milieux d’identification de la microméthode Micro CSB STAPHYLOCOQUE IV.2.1.2.1. - Milieux liquides ☻Préparation ► Les sucres Glucides Stérilisation Température et Durée Glucose 10 % Tréhalose 10 % Mannitol 10 % Xylose 10 % Saccharose 10 % Glycérol 10 % Mannose 10 % Lactose 10 % Raffinose 10 % Autoclavage Autoclavage Autoclavage Filtration Tyndalisation ou Filtration Autoclavage Autoclavage Tyndalisation ou Filtration Autoclavage 110°C 10 min. 110°C 10 min. 110°C 10 min. 60°C 30 min. x 3 jours 115°C 30 min. 110°C 10 min. 60°C 30 min. x 3 jours 110°C 10 min. 60 ► MEVAG STREPTO/STAPH Il s’agit d’une base de culture au rouge de phénol, commercialisée sous forme de poudre déshydratée, servant à la différenciation de cultures pures basées sur la réaction de fermentation. ■ Formule approximative par litre Réactifs Quantité - Extrait pancréatique de caséine 10,0g - Chlorure de sodium 5,0g - Rouge de phénol 0,018g ■ Mode d’emploi Suspendre 15g de poudre dans un litre d’eau distillée. Autoclaver le mélange à 118°C pendant 15 minutes. ► Autres milieux d’identification Milieu de FALKOW C’est le milieu de base pour la recherche des décarboxylases. Le milieu de FALKOW est commercialisé sous forme déshydratée. ■ Formule Réactifs Quantité - Extrait de levure 0,6g - Glucose 0,2g - NaCl 1g - Rouge de phénol 0,03g - Acide – Amine (L-ornithine ou L-arginine) 1g - Eau distillée qsp 100 ml Le milieu ainsi préparé doit être autoclavé à 120°C pendant 15 minutes et son pH ajusté à 6,3 – 6,4. 61 Milieu Urée - Tryptophane Il permet la recherche de l’uréase. ■ Formule Réactifs Quantité - L-tryptophane 0,6g - Phosphate monopotassique 0,2g - Phosphate dipotassique 0,2g - NaCl 1g - Eau distillée 100 ml Stérilisation par filtration. Milieu de CLARK et LUBS (VP) Le but de son utilisation est la mise en évidence de la production d’acétoïne. ■ Formule Réactifs Quantité - Peptone trypsique ou polypeptane 2,1g - Pyruvate de sodium 1,84g - Phosphate dipotassique 1,5g - Fumarate disodique 0,6g - Glucose 1,5g - Eau distillée 100 ml Ajuster le mélange à pH 7 et filtrer. Milieu à l’ONPG Il concourt à la caractérisation de la β-galactosidase. Les disques d’ONPG ont été immergées dans une solution de lactose à 10 % puis le milieu obtenu a été homogénéisé pour favoriser l’élution des disques. 62 Milieu pour la recherche de la nitrate réductase Il s’agit d’un bouillon nutritif nitraté. Le bouillon nutritif a la formule suivante : ■ Formule Réactifs Quantité - Peptone 0,5g - Extrait de viande 0,3g - Eau distillée 100 ml Ajuster à pH 7 et ajouter 2g de nitrate de sodium. Dissoudre et autoclaver à 121°C pendant 15 minutes. NB : avec du bouillon nutritif déshydraté, il suffit de dissoudre 1,6g de milieu sec dans 100 ml d’eau distillée pour préparer le bouillon. ► Réactifs de révélation ■ Potasse à 10 % (VP1) - potasse 10g - eau distillée 100 ml ■ Créatinine à 1 % (VP2) - créatinine 1g - eau distillée 100 ml ■ Alpha-naphtol (VP3) - naphtol 1g - éthanol 70°C 100 ml ■ Acide sulfanilique à 8 g/l (GRIESS I) - acide sulfanilique 0,8g - éthanol 95°C 100 ml 63 ■ Alpha-naphtylamine à 5 g/l (GRIESS II) - alpha naphtylamine 0,5g - éthanol 100 ml ☻Contrôle de qualité des milieux liquides Une fois qu’un lot de milieux liquides a été préparé, il est nécessaire de s’assurer de la stérilité et de l’efficacité de ces différents milieux. ► Test de stérilité Il est basé sur la mise en évidence de l’absence de souillures des milieux liquides préalablement préparés. ■ Technique Nous avons utilisé des tubes à hémolyse. Nous avons prélevé 2 ml de chaque milieu liquide et nous l’avons introduit dans un tube donné. Sur chaque tube, nous avons mentionné le nom du substrat introduit. Nous avons ajouté 1 ml d’eau physiologique stérile dans les tubes contenant les milieux allant de URE à NIT. Dans les tubes allant de Glu à RAF, nous avons ajouté 1 ml de MEVAG STREPTO/STAPH. Les tubes ont été fermés avec du coton et incubé à l’étuve à 37°C pendant 24H. ■ Interprétation et résultats Les milieux sont considérés comme stériles en l’absence de : - trouble du milieu - virage de l’indicateur coloré - coloration du milieu après ajout de réactifs de révélation pour les cupules concernées. 64 ► Test d’efficacité Ainsi, lorsqu’un milieu liquide a été considéré comme stérile, elle fait l’objet d’une étude en ce qui concerne sa capacité à donner un résultat positif avec une souche dont le caractère correspondant est positif et à donner un résultat négatif si ce caractère est négatif pour une autre souche donnée. De ce fait, pour chaque caractère biochimique (milieu liquide), une souche de contrôle a été choisie comme témoin positif et une autre comme témoin négatif. ■ Technique Nous avons réalisé une subculture de chaque souche de contrôle sur gélose au sang 24 à 48 heures. A partir des colonies prélevées avec soin de la gélose, nous avons réalisé pour chaque souche de contrôle un inoculum dont la turbidité est ajustée à celle de l’échelle 1 de l’étalon standard de Mac Farland, en délayant les colonies dans de l’eau distillée stérile. Nous avons distribué les milieux liquides dans les uploads/Geographie/ doc2-5.pdf