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13/10/2004 D. Thévenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt 1 Capteurs et biocapteu

13/10/2004 D. Thévenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt 1 Capteurs et biocapteurs électrochimiques Daniel Thévenot, Régis Moilleron & Gilles Varrault, Cereve Université Paris 12, ENPC, ENGREF (UMR-MA 102) http:// http://www.enpc.fr/cereve/HomePages/thevenot/thevenot.html www.enpc.fr/cereve/HomePages/thevenot/thevenot.html IUPAC commission I.7 de Chimie biophysique 13/10/2004 D. Thévenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt 2 Sommaire I 1. Capteurs / électrodes métalliques (EM) I 2. Capteurs / électrodes spécifiques ioniques (ESI) I 3. Capteurs / électrodes spécifiques à gaz (ESG) I 4. Biocapteurs / électrodes à enzymes Biocapteurs / électrodes à enzymes ou anticorps immobilisé(e)s ou anticorps immobilisé(e)s 5. Conclusions et perspectives Conclusions et perspectives 13/10/2004 D. Thévenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt 3 4. Biocapteurs électrochimiques 4.1. 4.1. Définition Définition des biocapteurs 4.2. 4.2. Classements Classements des biocapteurs 4.3. 4.3. Constituants Constituants des biocapteurs : sélectivité et sensibilité sélectivité et sensibilité, étape cinétiquement cinétiquement limitante 4.4. 4.4. Originalité Originalité des biocapteurs 4.5. 4.5. Utilisation de biocapteurs Utilisation de biocapteurs en milieux milieux aquatiques : possibilités & limites aquatiques : possibilités & limites 4.6. 4.6. Conclusion Conclusion et et perspectives perspectives I Sommaire 13/10/2004 D. Thévenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt 4 4. Biocapteur : 4.1. Définition (IUPAC) D.R. Thévenot, K. Toth, R.A. Durst & G.S. Wilson (1999) Electrochemical biosensors: recommended definitions and classification. Pure and Applied Chemistry, 71 (12), 2333-2348 I Self-contained, integrated integrated device I Nomenclature Biological Biological recognition element = receptor receptor Physico Physico- -chemical chemical transducer = transducer transducer I Ability to be repeatibly calibrated repeatibly calibrated either continuous continuous operation or rapidly and reproducibly regenerated regenerated 13/10/2004 D. Thévenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt 5 4. Biocapteur : 4.1. Définitions I Principe de fonctionnement & nomenclature Retour au sommaire biocapteur 13/10/2004 D. Thévenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt 6 4. Biocapteurs : 4.2. Classement I 4.2.1. Type de reconnaissance moléculaire reconnaissance moléculaire (récepteur) (récepteur) Catalyse Catalyse enzymatique, métabolisme cellulaire ou tissulaire fonctionnement continu possible véritable capteur ! enzyme purifié ou présent dans des cellules ou tissus oxydases, déshydrogénasses, hydrolases... Formation de bio bio- -complexe complexe: réaction immunologique, récepteur membranaire nécessité d’amplification d’amplification (enzyme, fluorescence...) et de régénération régénération (pour fonctionnement séquentiel) 13/10/2004 D. Thévenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt 7 4. Biocapteurs : 4.2. Classement I 4.2.1. Type de reconnaissance reconnaissance moléculaire moléculaire (suite) Mode de fonctionnement fonctionnement des membranes Catalytiques : fonctionnement continu Chélatantes : nécessité de régénération Caractère commun entre les 2 types de membranes à reconnaissance biologique Consommation Consommation (locale) de l’espèce mesurée : mesure stationnaire stationnaire (si agitation) ou transitoire transitoire 13/10/2004 D. Thévenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt 8 4. Biocapteurs : 4.2. Classement I 4.2.2. Type de transducteur transducteur associé Electrochimique Electrochimique ampérométrique, potentiométrique, conductimétrique, FET Optique Optique optrode, résonance de plasmon de surface (SPR) Enthalpimétrique Enthalpimétrique micro-calorimétrie Massique Massique quartz piézo-électriques, ondes acoustiques de surface 13/10/2004 D. Thévenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt 9 4. Biocapteurs : 4.2. Classement I 4.2.3. Classement par espèce Classement par espèce(s) détectée(s) Substrats Substrats de réactions biologiques sucres, acides aminés, alcools, phénols... Nutriments Nutriments micro-DBO Inhibiteurs Inhibiteurs, toxiques pesticides (organo-phosphorés), métaux, fluorures... 13/10/2004 D. Thévenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt 10 4. Biocapteurs : 4.2. Classement I Que retenir ? 1. Type de reconnaissance moléculaire Catalytique: enzyme(s) Chélatante: complexe antigène-anticorps Dans les 2 cas: consommation de substrat 2. Type de transducteur Ampérométrique Potentiométrique 3. Type d’espèce détectée Substrat Nutriment Toxique Retour au sommaire biocapteur Retour au sommaire biocapteur 13/10/2004 D. Thévenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt 11 4. Biocapteurs : 4.3. Constituants I 4.3.1. Mode d’immobilisation d’immobilisation du récepteur dans/sur la membrane Emprisonnement ou inclusion : facile, ± stable gel ou membrane préparée en présence d ’enzyme(s) Adsorption du membrane : facile & peu stable Liaison covalente, réticulation sur membrane : ± complexe mais stable activation de la membrane, activation de l ’enzyme et réaction spontanée contact d ’enzyme avec une membrane activée I I Stabilité Stabilité de l ’activité de la membrane 3 éléments: membrane + liaison + activité enzyme 13/10/2004 D. Thévenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt 12 4. Biocapteurs : 4.3. Constituants I 4.3.1. Mode d’immobilisation d’immobilisation du récepteur dans/sur la membrane Inclusion dans gel ou co-polymérisation Adsorption Adsorption & réticulation Liaison covalente Liaison covalente 13/10/2004 D. Thévenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt 13 4. Biocapteurs : 4.3. Constituants I 4.3.2. Rôle des cinétiques enzymatiques cinétiques enzymatiques hétérogènes hétérogènes -Enz -Enz -Enz -Enz Ssolution Réaction Transport Transducteur (électrode) Membrane) Transport Psolution Pmemb. Composition de la solution analysée modifiée, par la réaction, sur une épaisseur épaisseur δ δ δ δ δ δ δ δ (δ δ δ δ δ δ δ δ fonction de l ’agitation de la solution) S: substrat(s) P: produit(s) de la réaction catalysée par l ’enzyme 13/10/2004 D. Thévenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt 14 4. Biocapteurs : 4.3. Constituants I 4.3.2. Rôle des cinétiques enzymatiques cinétiques enzymatiques hétérogènes hétérogènes Transport Transport du/des substrat(s) S vers le site réactionnel (surface ou intérieur membrane) V = (DS / δ δ δ δ) (Ssolution - Smembrane) avec δ δ δ δ si agitation avec DS diffusion substrat S et δ δ δ δ épaisseur couche modifiée Réaction Réaction du/des substrat(s) S catalysée par l ’enzyme V = Vmax . Smembrane / (Smembrane + KM,S) avec Vmax activité enzymatique et KM,S (Michaelis) transport de partie du/des produits P vers le transducteur (réponse) et vers l ’échantillon (inutile) 13/10/2004 D. Thévenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt 15 4. Biocapteurs : 4.3. Constituants I 4.3.2. Rôle des cinétiques enzymatiques cinétiques enzymatiques hétérogènes hétérogènes Quelle étape la plus lente : cinétiquement cinétiquement limitante limitante? Transport Transport ou réaction réaction ? Régime diffusionnel diffusionnel si transport = étape la + lente Vmax / KM,S >> DS / δ δ δ δ forte activité immobilisée Vmax et/ou barrière diffusionelle externe (DS faible) réponse ‘ ind indé épendante pendante ’ de l ’activité immobilisée TB TB! ! Régime chimique chimique si réaction = étape la + lente Vmax / KM,S << DS / δ δ δ δ faible activité immobilisée et/ou forte agitation (δ δ δ δ ) réponse ‘ dépendante ’ de l ’activité immobilisée => peu souhaitable pour instrumentation analytique ! 13/10/2004 D. Thévenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt 16 4. Biocapteurs : 4.3. Constituants I 4.3.3. Transducteur Transducteur électrochimique associé Electrode métallique : H2O2, Fe(CN) 6 3/4 -… Electrode spécifique ionique : H30+, NH4+… Electrode spécifique à gaz : O2, CO2, NH3.. 1. Transducteur ampérométrique ou pH métrique 2. Membrane enzymatique Membrane perméable aux gaz 13/10/2004 D. Thévenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt 17 4. Biocapteurs : 4.3. Constituants I Que retenir ? 1. Immobilisation du récepteur (enzyme) Inclusion ou rétention Adsorption: peu stable Liaison covalente: stable mais plus complexe 2. Cinétiques hétérogènes Régime chimique: cinétique enzymatique limitante Régime diffusionnel: transport du substrat limitant (permet une plus grande stabilité du capteur) 3. Transducteur électrochimique EM (H2O2), ESI (pH) ou ESG (Clark, CO2, NH3…) Retour au sommaire biocapteur Retour au sommaire biocapteur 13/10/2004 D. Thévenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt 18 4. Biocapteurs : 4.4. Originalité I 4.4.1. Sélectivité: Sélectivité: détecteur & transducteur détecteur & transducteur Catalyse enzymatique: très / peu sélective glucose oxydase, alcools oxydase, amino-acides oxydase enzyme(s) purifié ou cellule / tissus biologique Anticorps mono- ou multi-clonal: très/peu sélective Transducteur associé: très / peu sélectif I 4.4.2. Amélioration de la sélectivité sélectivité Montage différentiel à 2 capteurs (≈ ≈ ≈ ≈colorimétrie) Membrane sélective supplémentaire acétate de cellulose (anionique): arrêt de l’ascorbate Transducteur électrochimique: Eappl. + faible utilisation de catalyseurs supplémentaires 13/10/2004 D. Thévenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt 19 4. Biocapteurs : 4.4. Originalité I 4.4.2. Amélioration de la sélectivité sélectivité Montage différentiel différentiel : soustraction des réponses suppression réponse aux interférents électrochimiques Capteur sans enzyme sans enzyme Biocapteur à enzyme enzyme 13/10/2004 D. Thévenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt 20 4. Biocapteurs : 4.4. Originalité I 4.4.3. Sensibilité Sensibilité plus élevée que si plus élevée que si réaction homogène (dosage par kit réaction homogène (dosage par kit enzymatique) enzymatique) Intégration de la reconnaissance moléculaire et de la transduction du/des produits de la réaction pas de dilution dans l’échantillon Amplification de la réaction principale à l’aide de réaction supplémentaire utilisation de seconde réaction enzymatique 13/10/2004 D. Thévenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt 21 4. Biocapteurs : 4.4. Originalité I 4.4.4. Stabilité Stabilité: méthodes d ’évaluation Stabilité opératoire opératoire (fonctionnelle) (fonctionnelle) même biocapteur, calibration séquentielle Stabilité au au stockage stockage différent biocapteurs issus d ’un même lot (homogène) de production Dépend de: membrane, enzyme, immobilisation Durée de vie Durée de vie: modes d ’expression Durée (quelques heures à quelques mois) I 50 % de décroissance de la sensibilité : t t1/2 1/2 I soit en fonctionnement fonctionnement soit au stockage stockage Vitesse de décroissance décroissance de la sensibilité : de la sensibilité : %/mois %/mois 13/10/2004 D. Thévenot: Capteurs-Electrochim-C-2004.ppt 22 4. Biocapteurs : uploads/Geographie/ capteurs-electrochim-c-2004.pdf