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AT 18 : Identification d’une bactérie pathogène A l’hôpital, malgré les mesures

AT 18 : Identification d’une bactérie pathogène A l’hôpital, malgré les mesures d’hygiène mises en place, les infections nosocomiales représentent un risque majeur pour les patients hospitalisés, notamment les plus faibles et les plus fragiles ou ceux qui ont subi une intervention chirurgicale. On se propose ici d’identifier une bactérie responsable d’infection nosocomiale. Objectifs technologiques →Techniques d’ensemencement : ensemencement d’une gélose VF, d’un milieu de Hugh et Leifson → Réalisation du test oxydase Dossier technique ✓ Fiche technique n°1 : La gélose lactosée au BCP ✓ Fiche technique n°2 : Le milieu de Hugh et Leifson ✓ Fiche diagnostic n°1 : Différenciation des bacilles Gram – cultivant en aérobiose sur milieu ordinaire Réflexion préliminaire Q1. Compléter la rubrique : « composition et rôles des composants » de la fiche technique n°1. Q2. Présenter la manipulation à réaliser sous forme d’un organigramme. PREMIER JOUR Réalisation pratique La bactérie isolée a été mise en culture sur gélose nutritive et incubée 24 heures à 37 °C. En utilisant le dossier technique fourni, T1- Réaliser une suspension bactérienne en eau distillée stérile en tube à hémolyse. T2- A partir de la suspension bactérienne, réaliser : • Un frottis coloré par la méthode de Gram. • L’ensemencement de la gélose Viande-Foie (VF) pour rechercher le type respiratoire. • L’ensemencement de la gélose Hugh et Leifson (HL) pour rechercher la voie d’attaque du glucose • L’isolement sur la gélose lactosée au BCP coulée en boîte de Pétri afin de vérifier la pureté de la culture repiquée et de lire le caractère LACTOSE en deuxième jour. T3- A partir de la culture sur gélose nutritive, réaliser le test d’orientation de diagnostic adapté. Présentation et exploitation des résultats Q3. Vérifier la pureté de la culture étudiée. Q4. Réaliser une description macroscopique d’une colonie isolée. Q5. Réaliser une description microscopique des bactéries colorées par la méthode de Gram. Q6. Donner le résultat obtenu au test d’orientation réalisé à T3. Q7. En vous aidant de la fiche diagnostic n°1, proposer une orientation de la souche étudiée vers la famille ou le genre présumé. DEUXIEME JOUR Lecture des résultats Q8. Vérifier la pureté de la culture sur la gélose lactosée au BCP et valider la lecture des milieux ensemencés (VF et H&L) si la culture est bien pure. Q9. Réaliser la description macroscopique des colonies isolées sur la gélose lactosée au BCP par la lecture du caractère lactose. Q10. Lire les milieux ensemencés : ~ Gélose VF : type respiratoire ~ Gélose HL : voie d’attaque du glucose Interprétation et conclusion Q11. En rassemblant tous les caractères pertinents, conclure par une identification de la famille ou du genre de la souche étudiée en utilisant la fiche diagnostic n°1. Q12. Sachant que dans la famille des entérobactéries, certains genres fermentent le lactose et d’autres ne le fermentent pas, conclure sur la bactérie responsable d’infection nosocomiale. Entérobactéries fermentant le lactose (genres) Entérobactéries ne fermentant pas le lactose (genres) Escherichia Klebsiella Citrobacter Enterobacter Proteus Providencia Morganella Salmonella Shigella Yersinia Serratia FICHE TECHNIQUE n°1 : La GELOSE LACTOSEE AU BCP COMPOSITION (en g/L) ET ROLES DES COMPOSANTS Peptones 5 Extraits de viande 2 Lactose 5 Pourpre de bromocrésol (BCP) 0,025 Agar 15 CARACTERISTIQUES C’est un milieu solide permettant la culture des germes de culture facile. C’est un milieu non sélectif qui permet de mettre en évidence le caractère lactose. Il est utilisé pour le dénombrement et l’identification des germes non exigeants. TECHNIQUE D’ENSEMENCEMENT Isoler selon la technique des quadrants. Incuber à 37 °C pendant 24 heures. LECTURE DES RESULTATS Il s’agit de : • Réaliser la description macroscopique des colonies isolées • Préciser le caractère biochimique : Caractère biochimique : Colonies jaunes + halo jaune Colonies violettes + halo violet Bactéries qui utilisent le lactose : LACTOSE + Bactéries qui n’utilisent pas le lactose : LACTOSE - FICHE TECHNIQUE n°2 : LE MILIEU HUGH-LEIFSON MISE EN EVIDENCE DE LA VOIE D’ATTAQUE DU GLUCOSE COMPOSITION (en g/L) ET ROLES DES COMPOSANTS Tryptone 2 Source de C, H, O et N sous forme d’acides aminés et petits peptides, source d’énergie Chlorure de sodium 5 Source minérale responsable de l’isotonie du milieu K2HPO4 0,3 Source minérale, rôle tampon pH Bleu de bromothymol 0,03 Indicateur coloré de pH Agar 2,5 Substance solidifiante, non métabolisable. CARACTERISTIQUES Milieu semi-solide destiné à rechercher la voie d’attaque du glucose des bactéries Gram (-) peu exigeantes. On détermine ainsi la nature du métabolisme fermentatif ou oxydatif. TECHNIQUE D’ENSEMENCEMENT Le milieu est régénéré au bain-marie à 100°C pendant 20 minutes, bouchon partiellement dévissé puis maintenu en surfusion vers 45-50°C. Il est additionné (extemporanément) de 10 gouttes de solution stérile de glucose à 30%. Après homogénéisation, il est solidifié en culot dans un bain d’eau froide. Il est ensuite ensemencé par piqûre centrale et incubé à l'étuve à 37°C pendant 24 heures, bouchon partiellement dévissé. LECTURE DES RESULTATS 10 gouttes de glucose à 30% Pipette Pasteur fermée Métabolisme oxydatif Bactéries glucose (+) oxydatif Métabolisme fermentatif Bactéries glucose (+) fermentatif Inerte vis-à-vis du glucose Bactéries glucose (-) Solution glucosée à 30% Milieu Hugh et Leifson Milieu Hugh et Leifson ensemencé par piqûre Bain d’eau froide Suspension bactérienne Solidification dans un bain d’eau froide FICHE DIAGNOSTIC n°1 : DIFFERENCIATION DES BACILLES GRAM (-) CULTIVANT EN AEROBIOSE SUR MILIEU ORDINAIRE AAF = Aéro-Anaérobie Facultatif / AS = Aérobie Strict / V = Variable Aspect microscopique au Gram Bacilles droits, Gram (-) de taille moyenne ou cocobacillaires Bacilles souvent incurvés Gram (-) de taille moyenne Bacilles droits Gram (-) fins ou cocobacillaires Oxydase - + Hypothèse d'orientation Enterobacteriaceae ou autres bacilles Gram (-) Ox (-) Vibrio Pseudomonas et genres apparentés Type respiratoire AAF AS AAF AS Attaque du glucose Voie fermentaire V Voie fermentaire Voie oxydative Réduction des nitrates + NO2 V + NO2 + N2 Mobilité Immobiles ou mobiles par ciliature péritriche V Mobiles par ciliature polaire Mobiles par ciliature polaire Conclusion : identification de la famille (f) ou du genre (g) Enterobacteriaceae (f) Autres bacilles Gram (-) Ox (-) Vibrio (g) Pseudomonas (g) TP PREMIERES STL AT 18 : Identification d’une bactérie pathogène Matériel Matériel Quantité par élève Tube à hémolyse stérile 1 Pipette Pasteur 5 Disque oxydase 1 Colorants de Gram 1/2 élèves Anse 3 Cultures et milieux (prévoir des quantités suffisantes en secours) Milieux Quantité par élève Souche pure de Proteus isolée sur GN Souche pure de Klebsiella isolée sur GN 1 (poste impairs) 1 (poste pairs) Gélose lactosée au BCP 1 Gélose VF (en surfusion) 1 Gélose Hugh et Leifson Glucose 30% stérile 1 1 Eau physiologique (5 mL) 1 ED stérile (5 mL) 1 uploads/Geographie/ at18-identification-d-amp-039-une-bacterie-pathogene.pdf