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UNIVERSITE DE KINSHASA FACULTE DE MEDECINE CLINIQUES UNIVERSITAIRES Département

UNIVERSITE DE KINSHASA FACULTE DE MEDECINE CLINIQUES UNIVERSITAIRES Département de Biologie Médicale SERVICE DE BIOLOGIE CLINIQUE T.P. DE BIOLOGIE CLINIQUE / G3 BIOMED. CONTEXTE La Biologie Clinique est un outil important qui concoure entre autre au diagnostic. Elle permet de faire une corrélation entre les perturbations biologiques et les manifestations cliniques. Les TP permettent de voir dans le concret et de manipuler le cas échéant les notions apprises au cours théorique, constituent un atout pour le futur clinicien qui, dès lors, aura la facilité de discuter un résultat qu’il juge douteux et d’avoir une confrontation clinico-biologique en rapport avec le diagnostic posé. OBJECTIFS A la fin des TP, l’étudiant doit être capable de : définir les analyses programmées pendant les TP; énoncer les principes des réactions de différents tests effectués ; énoncer l’intérêt clinique de différents tests effectués ; connaître le matériel approprié pour chaque analyse ; connaitre les valeurs de référence; réaliser correctement les analyses d’hématologie et de biochimie clinique effectuées lors des TP; interpréter les résultats observés. I. HEMOGRAMME ou NUMERATION FORMULE SANGUINE(NFS) 1 Définition : c’est l’étude des éléments figurés du sang en suspension dans le plasma, de l’hémoglobine et des constantes érythrocytaires. Cet examen est effectué sur du sang veineux prélevé sur un anticoagulant sec, EDTA ou Titriplex, le plus souvent. A défaut d'EDTA, on peut utiliser l'Oxalate de K ou de Na, sans fluorure. Quant à la formule sanguine, le sang est prélevé directement, en piquant le bout d'un doigt et en déposant une goutte de ce sang sur une lame porte-objet. Il comporte une étude quantitative (numération des GR et GB des plaquettes ; dosage de l’hémoglobine, mesure de l’hématocrite et établissement de la formule leucocytaire), et une étude qualitative (étude de la morphologie des éléments du sang (GB et GR), l’appréciation de la qualité des plaquettes sur le frottis sanguin, la présence de certaines particules comme le corps de Joly, le corps de Heinz,… et autres corps étrangers appelés artéfacts). L’hémogramme fournit quatre autres données complémentaires importantes :  V.G.M. : volume globulaire moyenne  C.C.M.H. : concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine  T.C.M.H. : teneur corpusculaire moyenne en hémoglobine  Réticulocytes : jeunes globules rouges NB: EDTA ( Ethylène Diamine Tétra Acetic Acid, sel sodique) Prélèvement Prélever 5ml de sang sur EDTA (éviter les anticoagulants liquides comme l’héparine, afin d’éviter les erreurs de comptage dues à la dilution du sang par excès de liquide). En cas de transport de l'échantillon sur une longue distance, maintenir de préférence entre 2 et 8°C (température du frigo). Il n'est pas nécessaire d’être à jeun ; la digestion provoque certes une leucocytose mais très discrète < 5%. Mais il faut être au repos car l’effort physique, même bref, peut provoquer des hyperleucocytoses ou augmentation des GB. Technique 2 On distingue deux grands groupes de méthodes de mesure :  méthodes automatiques  méthodes manuelles a) Méthodes Automatiques Utilisent deux types de compteurs optiques ou électroniques analyseurs des particules cellulaires, ayant comme principe : *Détection volumétrique par variation d’impédance ; ici les particules traversent un micro-orifice et il se crée une DDP (différence de potentiel) entre les deux électrodes (variation de résistivité). *Détection optique en flux continu ; ici, les particules passent un micro tube au même moment qu’un faisceau lumineux perpendiculaire qu’ils absorbent en partie et qu’ils diffractent aussi en partie. L’absorption et la diffraction de la lumière permettent la numération et la mesure de volume. b) Méthodes Manuelles Sont encore précieuses, très répandues dans notre pays et nécessitent un prélèvement d’une quantité précise de sang, des réactifs diluants et des cellules hématimètres ou chambre à numération (NEUBAUER, BURKER, MALASSEZ, NAGEOTTE, THOMAS, ROSENTHAL, …). Il est à noter que l’utilisation des compteurs a permis de diminuer les marges d’erreur. * Intérêt Clinique  détermination de l’anémie ;  caractérisation de l’anémie, dans ce dernier cas, on a besoin du taux de l’hémoglobine, de l’hématocrite et du nombre des GR. a) anémie normocytaire : 3  Hct = Hb X 3+2 ; dans ce cas, la formule se maintient mais l’Hct et l'Hb sont parallèlement diminuées. L'anémie est quantitative, par perte sanguine : hématémèse récente, hémolyse, mélaena, ulcère gastrique, hémorragie traumatique récente. b) anémie macrocytaire :  Hct > Hb X 3+2 ; ici, l’anémie est causée par une baisse de l’Hb. L’anémie est qualitative par diminution préférentielle de l’Hb ; en cas de malnutrition, manque de fer, immaturité du GR, brûlure. c) anémie microcytaire :  Hct < Hb X 3+2 ; ici, l’anémie est caractérisée par la baisse du volume globulaire (sphérocytose, microcytose avec hémolyse, hémodilution). Les constantes globulaires sont calculées sur base des formules suivantes : VGM = Ht/GR X 10 → Valeurs normales 90 ± 10 fl TCMH = Hb/GR X 10 → » 29 ± 3 pg CCMH = Hb/Ht X 100 → » 34 ± 4 % - Intérêt pour la numération des GB et l'établissement de la FL. 1. DOSAGE DE L’HEMOGLOBINE (Hb) Définition L’hémoglobine est une hétéroprotéine formée d’un groupement prosthétique (Hème) et d’un groupement protéine appelé globine. C’est le transporteur de l’O2 dans le sang, le CO2, certaines molécules médicamenteuses,.... Principe 4 La transformation de l’hémoglobine en cyanméthémoglobine dont la densité optique (D.O) est lue au spectrophotomètre à la longueur d’onde de 540nm. Les GR contenus dans l’échantillon sanguin total sont lysés par la solution de ferricyanure de potassium K3 [Fe(CN)6] , qui oxyde l’Hb en méthémoglobine(met-Hb). La met-Hb formée est complexée avec le cyanure de K+ (KCN) en cyanméthémoglobine, composé stable, dont l’absorbance est proportionnelle à la concentration. *Matériel et Réactifs  Tube à essai  Micropipette ou pipette de Sahli  Pipette graduée  Poire d'aspiration  Spectrophotomètre  Courbe d’étalonnage  Réactif : Solution de DRABKIN (1g de HCOˉ3 ; 0,2g de KCN ; 0,2g de K3Fe(CN) 6 ; 1vol. d’ H2O distillée);à conserver dans un flacon en verre blanc bouché à l’émeri.  Echantillon de sang veineux prélevé sur EDTA ou sang capillaire. Mode opératoire  prélever 5ml de Drabkin (sol.de ferricyanure de K+) dans un tube à essai; y ajouter 20μl de sang rendu incoagulable (sang prélevé sur Anticoagulant), homogénéiser en mélangeant par un mouvement de retournement ou à l’aide d’un mélangeur automatique.  Toujours essuyer l’embout sans toucher le bout avant de déposer le sang prélevé, car nous travaillons avec de petits volumes. Les mesures peuvent être faussées si la solution de drabkin est trouble, cas des solutions déjà anciennes, à écarter ;  laisser reposer le mélange pendant 5minutes pour faciliter la réaction; 5  procéder à la lecture au spectrophotomètre à la longueur d’onde de 540nm après calibrage de l’appareil avec du blanc;  rapporter le chiffre obtenu à la courbe d’étalonnage afin de déterminer la valeur de l’hémoglobine (la D.O. obtenue est proportionnelle au taux d’Hb).  La courbe d’étalonnage donne la concentration en g d’Hb pour 100ml de sang (actuellement en mol/l, plus exactement en mmol/l). Interprétation des résultats Homme : 12,5 – 18 g/dl ou 1,9 – 2,8 mmol/l Femme : 10,5 – 15 g/dl ou 1,6 – 2,3 mmol/l Enfant (1 à 10ans) : 11,2 – 12,9 g/dl ou 1,8 – 2,0 mmol/l Nouveau-né : 15,6 – 19,6 g/dl ou 2,1 – 3,0 mmol/l 2. MESURE DE L’ HEMATOCRITE (Ht) Définition  Le terme hématocrite signifie étymologiquement, séparation entre le plasma et les éléments figurés du sang notamment les globules rouges.  C’est en fait la fraction des éléments figurés en pourcentage du sang total ou encore le volume qu’occupent les GR et autres éléments figurés dans 100ml de sang. Principe La centrifugation du sang total jusqu’à ce que les éléments aient atteint un volume minimal. La hauteur de la colonne des cellules est ensuite comparée à la hauteur totale qui représente 100%. Matériels  Tube capillaire hépariné ou non (micro tube capillaire)  Micro centrifugeuse à hématocrite 6  Hématocritomètre ou abaque  Plasticine (ou Mastic): pour boucher l’extrémité du tube par  laquelle l’échantillon de sang a été prélevé  Echantillon de sang veineux prélevé sur EDTA ou échantillon de  sang capillaire. Mode opératoire  Homogénéiser préalablement le sang contenu dans le flacon par des mouvements de retournement ou à l’aide d’un mélangeur automatique pour ramener tous les éléments figurés en suspension et rendre ainsi l’échantillon homogène.  A l’aide d’un tube capillaire, prélever du sang jusqu’au ¾.  Boucher l’extrémité du tube par laquelle on a prélevé, avec de la plasticine ou du mastic.  Placer le tube sur le plateau de la micro centrifugeuse avec le bout bouché du coté externe, en assurant l’équilibre avec un autre tube en regard du tube contenant l’échantillon.  Centrifuger pendant 5 min à 3000 tours/min.  Faire la lecture à l’aide de l’abaque en mesurant la hauteur du culot globulaire par rapport à la hauteur totale. *Interprétation des résultats Homme : 38 - 52% Femme : 32 - 42% Enfant (1 à 10ans) : 35 – 37% Nouveau-né : 44 – 62 3. NUMERATION DES GLOBULES BLANCS (GB) Principe 7 Le sang est dilué uploads/Finance/ fascicule-tp-bioclin-corrige.pdf